Cermin Dunia Kedokteran

TEKNIK

Teknik lmunodiagnostik

dalam Masyarakat

I. Prinsip-prinsip dasar teknik imunodiagnostik

Iwan H. Utama, I Nym. Suarsana

Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, Jimbaran-Bali

RINGKASAN

Teknik imunodiagnostik berdasarkan reaksi antigen dan antibodi banyak

digunakan dalam bidang pertanian, kesehatan dan pengawasan lingkungan. Dalam

tulisan ini dibahas prinsip-prinsip dasar teknik imunodiagnostik, terutarna aspek

kimiawinya. Selain itu juga dibahas faktor-faktor yang dapat mempengaruhi hasil

reaksi tersebut.

PENDAHULUAN

Salah satu teknik yang banyak digunakan dalam bidang

kesehatan serta pengawasan mutu bahan pangan dan hasil

olahannya ialah teknik imunodiagnostik. Teknik imunodiag-

nostik cukup luas dan bervariasi, semuanya berdasarkan reaksi

sistim kekebalan dalam tubuh manusia yang diaplikasikan

secara in vitro

(1)

. Imunoassay merupakan salah satu teknik

imunodiagnostik paling banyak digunakan. Teknik ini ber-

dasarkan reaksi kimia antara dua jenis analit (antigen dan anti

bodi) yang dapat rnemberi hasil bervariasi bergantung indi-

katornya. Sebagai indikator biasanya digunakan bahan

radioaktif biasanya yodium 125 (radioimmunoassay/RIA),

sistim enzim -substrat tertentu seperti peroksidase-kloronaftol,

fosfatase-bromo-kloro-indolinfosfat, zat golongan fuorokrom

atau fluoresen don lain-lain

(3)

Reaksi antigen dan antibodi in vitro

Reaksi antigen (Ag) don antibodi (Ab) dapat dinyatakan

sebagai berikut :

Ag-Ab

Ag + Ab <--> Ag-Ab (kompleks antigen-antibodi) dengan K =

(Ag) x (Ab)

Berdasarkan prinsip ini, sistim reaksi dapat dikategorikan

menjadi reaksi dengan antibodi berlebih (tipe 1): Ag+Ab <-->

Ag-Ab+Ab berlebih; dan reaksi dengan antigen berlebih (tipe

2), yaitu: Ag + Ab <--> Ag - Ab + Ag berlebih

(2)

. Reaksi tipe

1 kurang dipengaruhi oleh faktor lingkungan yang depat mem-

pengaruhi kinetika reaksi seperti jarum dan urea, selain itu

lebih sensitif jika dibandingkan dengan reaksi tipe 2. Reaksi

tipe 2 dipengaruhi oleh pelabelan antigen; karena umumnya

antigen terdapat dalam jumlah sedikit dalam bahan yang diuji,

maka tipe 2 kurang populer jika dibanding dengan tipe 1

(4)

Selain prinsip reaksi kimianya, sistim imunoassay juga

dapat dilakukan (diformat) dalam dua sistim, yaitu sistim

heterogen yang memerlukan pemisahan dan sistim homogen

yang tidak memerlukan pemisahan reaktan pasta reaksi. Pada

sistim heterogen, sifat label sebelum dan sesudah reaksi tetap

sama, jadi perlu pemisahan komponen reaktan yang berlebih

dengan kompleks Ag-Ab yang terbentuk, sebab kuantitas

kompleks ini yang akan dihitung. Pada sistim homogen, sifat

label sebelum dan sesudah reaksi sangat berbeda, jadi tidak

perlu lagi pemisahan komponen reaktan secara fisis

(5)

Berdasarkan mekanisme reaksinya, sistim imunoassay

dapat dikategorikan menjadi assay kompetitif dan non kom-

petitif, sistim terakhir ini prinsip dasarnya sama dengan prinsip

peran substrat-inhibitor dalam reaksi enzimatis

(6)

. Gabungan

dari sistim di etas menghasilkan produk-produk imunodiag-

nostik komersial dengan enam model reaksi dasar

(7)

Keenarn model tersebut ialah :

1) Assay kornhetitif meuggoncrkan antigen terlabel

(Gambar 1) bertujuan mendeteksi antigen dengan konsentrasi

antibodi yang terbatas dan mengunakan antigen serupa yang

dilabel sebagai kompetitornya. Nilai yang diukur biasanya

kompleks Ag-Ab. Karena sifatnya kompetitif maka antibodi

yang sudah mengikat antigen alami tidak mampu lagi meng-

ikat antigen terlabel. Dengan menggunakan antibodi yang

spesifisitasnya tinggi, assay ini dapat mendeteksi 210

-15

Mol.

antigen dalam contoh bahan.

Gambar 1. Reaksi model 1: Suatu assay kompetitif dengan antigen

(E-L) terlabel enzim dan antigen tidak terlabel (L)

berkompetisi untuk mendapat tempat di molekul antibodi

yang terbatas dan terikat (immobilized) pada suatu fasa

padat.

Cermin Dunia Kedokteran No. 130, 2001 55

2) Assay kompetitif menggunakan antibodi berlabel (Gambar

2) dengan tujuan sama seperti point 1 di atas. Assay ini biasa-

nya digunakan jika sifat antigen dapat mempengaruhi label

yang digunakan.

Gambar 2. Reaksi model 2: Assay kompetitif dengan antibodi terlabel

enzim (E-AB). Antigen (L) terikat pada suatu fasa padat dan

antigen dari contoh berkompetisi untuk mendapat tempat

pada molekul antibodi terlabel enzim yang terbatas.

Assay kompleks Ag-Ab (Gambar 3) bertujuan mendeteksi

antigen atau antibodi; cara ini paling banyak digunakan di

bidangdiagnostik atau biomedis. Secara teknis relatif seder-

hana dan murah. Prosedur seperti reaksi aglutinasi, imuno-

difusi ganda dan presipitasi berazaskan model ini. Biasanya

dalam model ini tidak menggunakan label dan kepekaannya

terbatas, meskipun demikian reaksi imunodifusi dapat men-

deteksi 0,005 µg protein/ml suspensi

(8)

Gambar 3. Reaksi model 3: Assay kompleks antigen-antibodi. Antibodi

(Y) yang diikatkan pada suatu partikel akan beragregasi

jika bereaksi dengan suatu antigen homolog yang multivalen

(MVA).

4) . Sandwich assay (Gambar 4) merupakan metode yang

lebih modern dan luas penggunaannya. Prinsipnya hampir

sama dengan model 3, tapi antigen yang digunakan biasanya

dapat berikatan dengan dua atau lebih antibodi yang berbeda

spesifisitasnya. Salah satu reaktan (biasanya antibodi) terikat

(immobilized) pada matrix tertentu seperti polistirene

(9)

dan

pada antibodi lainnya diberi label. Sandwich assay inipun

bermacam-macam prinsipnya

(9)

. Enzyme Linked Immuno

Sorbent Assay (ELISA) termasuk dalam model ini. Model ini

lebih peka dari model 1, dapat mendeteksi 10

-18

Mol. antigen

dalam bahan yang diuji.

Gambar 4. Reaksi model 4: Imunoassay "sandwich" dimana suatu

antigen multivalen (L) pertama-tama diikatkan pada suatu

antibodi poliklonal (AB-1) yang telah diimobilisasi. Antigen

tersebut kemudian dideteksi dengan antibodi ke dua (AB-2)

yang telah diberi label enzim.

Assay non kompetitif (Gambar 5) dengan tujuan men-

deteksi antibodi dalam serum (berbeda dengan model sebe-

lumnya). Antigen yang digunakan biasanya berlebih dan

terikat pada matrix tertentu, serum yang akan dideteksi jenis

antibodinya (antibodi primer) direaksikan dengan antigen

tersebut. Reaksi ini memerlukan suatu anti-antibodi (antibodi

sekunder) terhadap antibodi yang akan dideteksi tadi. Antibodi

sekunder inilah yang biasanya dilabel dan dapat bereaksi

dengan bagian Fc dari molekul antibodi primer, sehingga

kandungan antibodi dalam serum dapat ditentukan.

Gambar 5. Reaksi model 5: Assay nonkompetitif berdasarkan ikatan

antibodi-antibodi. Antigen diikatkan pada suatu fasa padat,

dan antibodi homolog (AB-1) akan berikatan dengannya.

Antiantibodi (AB-2) terhadap AB-1 yang telah terlabel

enzim akan berikatan dengan AB-1 dan jumlahnya dapat

ditentukan secara kuantitatif.

6). Assay bebas pemisahan pada reaksi (sistim homogen)

(Gambar 6) dengan tujuan sama seperti model 1, 2, dan 3, tapi

pembacaan hasil reaksi ditentukan oleh sifat label yang

memang berbeda sebelum dan sesudah reaksi; oleh sebab itu

sistim ini tidak memerlukan pemisahan pasca reaksi.

Cermin Dunia Kedokteran No. 130, 2001

Gambar 6. Reaksi model 6: Immunoassay bebas pemisahan. Aktivitas

enzim yang terikat pada antigen (E-L) akan dihambat,

dengan kata lain konversi substrat (S) menjadi produk (P)

akan dicegah jika antigen tersebut berikatan dengan

antibodi.

Teknik ini banyak digunakan dalam laboratorium klinik

dan forensik seperti kasus penyalahgunaan obat. Assay ini

biasanya kurang peka jika dibandingkan dengan yang sistim

homogen.

Tabel 1 memperlihatkan contoh-contoh teknik immuno-

assay dengan beberapa enzim atau senyawa tertentu sebagai

indikatornya. Dari Tabel 1 dapat dilihat penentuan kuantitatif

teknik ini tetap memerlukan prinsip-prinsip analitik modern.

Tabel

1. Contoh teknik immunoassay dengan bermacam-macam

indikator dan teknik pengukurannya

(5)

Macam-macam label

Prinsip analitik/cara pengukurannya

Immunoassay enzim heterogen :

1. Peroksidase

1. Fotometri, luminometri

2. Alkalin fosfatase

2. Fotometri, fluorimetri

Immunoassay enzim homogen :

1. Lysozyme

1. Turbidimetri

-D Galaktosidase

2. Fotometri, turbidimetri

3. Glukosa 6 fosfat dehidrogenase 3. Fotometri, fluorimetri

Fluorescent :

I. Senyawa turunan koumarin

1. Fluorimetri

2. Rhodamin

2. Fluorimetri

Ligand :

I. Senyawa avidin-biotin dan

turunannya

1. Sistem enzim terbiotinilasi,

luminometri csteravidin-akridinium,

avidin enzim fotometri dan lain-lain.

Luminesen :

1. Ester akridinium

1. Luminometri

2. Senyawa turunan isoluminol

2. Luminometri

Partikel :

1. Latex

1. Nefelometri, turbidimetri, visual

2. Bakteri terwarnai

2. Visual

3. Eritrosit (uji hambat

hemaglutinasi)

3. Visual

Radioisotop :

1. Co

, I

125

, H

1. Perhitungan sintilasi padat

Vesikel :

1. Liposom

1. Pejeratan zat warna, fotometri enzim

Metal koloid :

1. Perak, emas dan senyawa-

senyawanya

1. Emisi absorbsi, spektroskopi

fluoresen, absorbsi atom,

2. Barium sulfat

nefelometri

Spin :

1. Radikal nitroxida

1. Spektroskopi resonansi spin elektron

Teknik imunodifusi ganda merupakan teknik yang luas

penggunaannya baik di bidang kesehatan maupun bidang

teknologi pangan, misalnya menguji keberadaan daging babi

atau ekstraknya dalam suatu produk makanan. Dengan mern-

buat antisera spesifik terhadap daging babi (antisera biasanya

dibuat pada kelinci), dapat dilacak keberadaan daging babi dan

ekstraknya dalam suatu produk makanan tertentu untuk men-

jamin kehalalannya. Prinsip teknik ini dengan mendifusikan

suatu ekstrak antigen terlarut (biasanya protein daging) dan

antibodinya (berupa serum) dalam suatu matrix agar atau gel

padat dengan arah 2 dimensi dan berhadapan

(10)

. Jika antibodi

tersebut sesuai dengan antigennya, maka terjadi reaksi yang

menimbulkan garis endapan putih, hal ini berarti contoh

produk positif mengandung ekstrak daging babi yang diuji.

Teknik imunodifusi memerlukan komposisi agar atau gel,

konsentrasi dan jenis garam dalam perbandingan tertentu

untuk jenis bahan yang diuji, untuk ini perlu penelitian pen-

dahuluan untuk menentukan komposisi tersebut. Dalam per-

kembangannya, antibodi monoklonal menambah aset dalam

spesifisitas dan sensitivitas teknik imunodiagnostik

(11)

Reaksi antigen dq antibodi merupakan reaksi yang sangat

peka terhadap pengaruh lingkungan seperti pH, suhu, kon-

sentrasi garam, konsentrasi antigen-antibodi itu sendiri, da

lain-lain

(12)

. Faktor seperti kepekaan dan spesifisitas yang ting-

gi, kemudahan teknis, ekonomis, dan biohazard yang rendah

tetap menjadi prioritas utama dalam pengembangan teknik

imunodiagnostik yang perjalanannya begitu cepat.

KESIMPULAN

Teknik imunodiagnostik yang beragam memerlukan

pengetahuan dasar imunologi atau imunokimia yang rnemadai

dalam pemilihan untuk aplikasinya, tampaknya teknik imuno-

difuasi masih tetap banyak dipakai karena sederhana, hasilnya

cukup cepat diketahui dan ekonomis.

KEPUSTAKAAN

1. Coates ARM. Immunocytochemistry of microorganisms. In

Immunocytochemistry 2

. Ed. By JM. Polack and S. Van Noorden

(Eds). John Wright and Sons Ltd. Bristol, England 1986 : 650-63.

2. Harlow ED, Lane D. Antibodies; a laboratory manual. Cold Spring

Harbor Laboratory, USA. 1988 :554-612.

Roitt IM. Essential immunology 7

. ed. Blackwell Scient Publ, London.

1991: 85-103.

Gow IF, Williams BC. Immunoassays for antigens. Curr. Op. Immunol.

1989; 1: 940-47.

5. Deshpande SS. Immunodiagnostics in agricultural, food, and environ

mental quality control. Food Technol. 1994; 6: 136-41.

6. Stryer L. Biochemistry. WH. Freeman-San Francisco. USA. 1988:

192-9.

Goshling JPA. A decade of development in immunoassay methodology.

Clin. Chem. 1990; 36: 1408-27.

Silverstein AM, Thorbecke GJ, Kramer KL, Lukes KJ. Fetal response to

antigenic stimulus III.

-Globulin production in normal and stimulated

fetal lams. J. Immunol. 1963: 91: 384-95.

Burgess GW. Basic principles of ELISA and variation in configuration.

In Burgess, G.W. (Ed.) ELISA technology in diagnosis and research.

Graduate School of Tropical Veterinary Science James Cook University

of North Queensland, Townsville Australia. 1988 : 27-36.

10. Crowle AJ. Immunodiffusion 2

. Ed. Academic Press, London, 1973;

247-302.

11. Lane D, Koprowsky H. Molecular recognition and the future of

monoclonal antibodies. Nature 1982; 296: 34-8.

12. Johnstone A. Immunological techniques. Curr. Op. Immonul. 1989; I:

927-28.

Cermin Dunia Kedokteran No. 130, 2001 57