HASIL PENELITIAN
Pertumbuhan Isolat B.thuringiensis
pada Media Kelapa
dan Uji Patogenitasnya terhadap
Jentik Nyamuk Vektor
Blondine Ch.P, Umi Widyastuti, Sukarno, Subiantoro
Stasiun Penelitian Vektor Penyakit Departemen Kesehatan RI, Salatiga, Indonesia
ABSTRAK
Pertumbuhan isolat Bacillus thuringiensis pada media kelapa, dan uji patogenisitas
nya terhadap jentik beberapa nyamuk, telah dilakukan di Laboratorium Jazad Hayati,
Stasiun Penelitian Vektor Penyakit Salatiga. Enam contoh tanah diambil dari 2 habitat
yaitu lubang pohon kweni, kelapa dan trembesi serta tanah yang berada di bawah pohon
kelapa di 3 lokasi penelitian yaitu desa Teluk Dalam, Bawonifaoso, dan Legoksari. Isolasi
6 contoh tanah, memperoleh 9 isolat B. thuringiensis. Uji patogenisitas 9 isolat tersebut
yang ditumbuhkan pada media air kelapa dan endosperm kelapa, terhadap jentik Aedes
aegypti dan Culex p. quinquefasciatus instar III, menunjukkan 88,9100,0% mempunyai
patogenisitas > 50% selama 24 dan 48 jam pengujian. Media kelapa (air kelapa dan
endospermnya) dapat digunakan untuk menumbuhkan B. thuringiensis.
PENDAHULUAN
Bacillus thuringiensis var israelensis (H- 14) secara umum
diproduksi sebagai larvisida jentik nyamuk dan jentik lalat hitam
(1)
.
Salah satu karakteristik dan B. thuringiensis adalah dapat mem-
produksi kristal protein dalam sel selama fase sporuIasi Kristal
toksin memegang peranan penting karena aktivitasnya sebagai
insektisida
(2)
. Untuk menumbuhkan dan memperbanyak kristal
dan spora B. thuringiensis telah digunakan berbagai media kimia
seperti agar nutrien, media NYSMA, NYPC dan Tryptose Phos-
phate Broth
(3,4)
. Beberapa peneliti tidak menggunakan media
kimiawi untuk menumbuhkan B. thuringiensis, melainkan meng-
gunakan media alami seperti berbagai media kelapa (air dan
endospermnya)
(5-9)
. Media kelapa relatif murah, dapat diperoleh
setiap saat dan terdapat di mana-mana, sedangkan media kimia
harganya mahal dan tidak mudah diperoleh. Air kelapa dan
endosperm kelapa (santan) kaya akan asam amino, gula dan
garam serta merupakan media yang cocok untuk pertumbuhan B.
thuringiensis
(10-12)
. Berdasarkan informasi di atas, maka pene-
litian ini dilakukan untuk menumbuhkan isolat B. thuringiensis
pada media kelapa serta uji patogenisitasnya terhadap jentik
nyamuk Aedes aegypti dan Culex p. quinquefasciatus.
METODOLOGI PENELITIAN
Bahan Penelitian
Sembilan isolat B. thuringiensis diisolasi dari berbagai
habitat tanah di 3 lokasi penelitian, yaitu desa Teluk Dalam dan
Bawonifaoso (Kecamatan Teluk Dalam) dan desa Legoksari
(Kecamatan Sidorejo), dengan metoda Chilcott dan Wigley
(3)
,
Sebelum digunakan, isolat-isolat ini disimpan pada media
NYSMA, pada suhu4°C.
Jentik nyamuk yang digunakan adalah Ae. aegypti dan Cx.
p. quinquefasciatus.
Media
Media yang digunakan adalah air kelapa dan endosperm
kelapa (santan) serta media tryptose phosphate broth (TPB) se-
bagai media standar.
Cara
A) Media air kelapa
Kepala yang digunakan adalah kelapa kering. Sebelum di-
Cermin Dunia Kedokteran No. 119, 1997
50
gunakan, terlebih dahulu dilubangi dan ambil 150 ml air kelapa
dengan cara dituangkan langsung ke dalam gelas Erlenmeyer
steril berukuran 250 ml. Sebelum air kelapa digunakan, disimpan
di refrigerator pada suhu 4°C.
B) Media endosperm kelapa
Endosperm kelapa 15 gram diparut. Sebelum diparut, dicuci
terlebih dahulu dengan alkohol 70%. Ke dalam parutan kelapa,
ditambahkan 150 ml distilled water (DW) dan dipanaskan selama
2 menit, kemudian disaring menggunakan penyaring yang sudah
disterilkan. Santan kelapa yang belum digunakan, disimpan pada
temperatur 20°C.
C) Pertumbuhan dan Uji patogenisitas isolat B. thuringiensis
Isolat B. thuringiensis yang disimpan pada media NYSMA,
diambil 2 ose penuh (loopful), kemudian dimasukkan ke dalam
50 ml tryptose phosphate broth (TPB), dan diinkubasikan pada
suhu 30°C selama 24 jam. Sesudah inkubasi, ke dalam media air
kelapa dan endosperm kelapa masing-masing ditambahkan 5 ml
broth (diambil dari 50 ml TPB). Ulangan dilakukan sebanyak 3
kali. Media air kelapa dan endosperm kelapa, digoyang pada
temperatur kamar selama 48 jam. Sesudah 48 jam, masing-
masing media diberi 25 jentik Ae. aegypti instar III. Peng-
amatan dilakukan selama 24 dan 48 jam pengujian. Sebagai
kontrol, masing-masing media hanya diberi 25 ekor jentik Ae.
aegypti. Uji patogenisitas terhadap Cx. p. quinquefasciatus di-
lakukan seperti cara yang sama.
Sembilan isolat B. thuringiensis ditumbuhkan pada media
tryptose phosphate broth (media standar) dan uji patogenisi-
tasnya dilakukan menurut metoda Chilcott & Wigley
(3)
, sebagai
berikut :
Biakan murni dan masing-masing isolat diambil 2 ose penuh
dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer berukuran 250 ml yang
diisi dengan 50 ml TPB (Oxoid, Unipath Ltd. Basingstoke,
Hampshire, England). Isolat-isolat tersebut digoyang pada suhu
kamar selama 48 jam. Masing-masing isolat diuji patogenisitas-
nya dengan cara sebagai berikut : Diambil 15 ml biakan murni
dimasukkan ke dalam mangkok plastik berisi 100 ml air suling
dan 25 jentik Ae. aegypti instar III (umur 67 hari). Sebagai
kontrol, mangkok plastik hanya diisi 150 ml air suling dan 25
jentik Ae. aegypti instar III. Ulangan dilakukan sebanyak 3 kali.
Pengamatan dilakukan 24 dan 48 jam sesudah pengujian. Uji
patogenisitas terhadap Cx. p. quinquefasciatus dilakukan dengan
cara yang sama.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari enam sampel tanah yang diisolasi di 3 lokasi penelitian,
ditemukan 9 isolat positif B. thuringiensis (Tabel 1). Isolat-isolat
ditumbuhkan pada media air kelapa, endosperm kelapa (santan)
dan media TPB. Uji patogenisitas 9 isolat terhadap jentik Ae.
aegypti instar III, disajikan pada Tabel 2.
Uji patogenisitas 9 isolat yang ditumbuhkan pada media
endosperm kelapa, terhadap jentik Ae. aegypti instar III, me-
nunjukkan 9 isolat (100,0%) mempunyai patogenisitas> 50%
(82,7100,0%) pada 24 jam pengujian dan 100% selama 48 jam
pengujian. Uji patogenisitas 9 isolat yang ditumbuhkan pada
media air kelapa terhadap jentik Ae. aegypti instar III, menun-
Tabel 1. Hasil isolasi Bacillus thuringiensis dan tanah di tiga lokasi pe-
nelitian
No.
Lokasi Habitat
Jumlah
sampel
tanah
Hasil
isolasi
B. thuringiensis
1
Teluk Dalam
Lubang pohon kweni
1
+
Bawah pohon kelapa
2
+
2
Bawonifauso
Lubang pohon kelapa
1
+
Bawah pohon kelapa
I
+
Legoksari
Lubang pohon trembesi
1
+
jukkan 9 isolat (100,0%) yang mempunyai patogenisitas >50%
(100,0%) selama 24 dan 48 jam pengujian. Uji patogenisitas 9
isolat B. thuringiensis yang ditumbuhkan pada media TPB, ter-
hadap jentik Ae. aegypti instar III, menunjukkan 9 isolat (100,0%)
mempunyai patogenisitas > 50% yaitu 70,093,3% pada 24 jam
pengujian, serta 81,3100,0% selama 48 jam pengujian. Uji ter-
hadap persentase kematian jentik Ae. aegypti dari 9 isolat yang
ditumbuhkan pada media endosperm kelapa dan media TPB,
tidak menunjukkan beda nyata (p > 0,05) pada 24 dan 48 jam
pengujian. Demikian pula uji t yang dilakukan terhadap persen
tase kematian jentik Ae. aegypti dari 9 isolat yang ditumbuhkan
pada media air kelapa dan media TPB, tidak menunjukkan beda
nyata (p > 0,05) pada 24 dan 48 jam pengujian. Hal ini berarti
bahwa media kelapa dapat digunakan sebagai pengganti media
TPB. Uji patogenisitas 9 isolat yang ditumbuhkan pada media
endosperm kelapa (santan), terhadap jentik Cx. p. quinquefascia-
tus instar III, menunjukkan 8 isolat (88,9%) mempunyai
patogenisitas > 50% (65,0100%) dan 1 isolat (11,1%) <50%
(36,0%), selama 24 jam pengujian. Pada 48 jam pengujian, di-
peroleh 9 isolat(100,0%) mempunyai patogenisitas >50% yaitu
78,7100,0% (Tabel 3). Uji patogenisitas 9 isolat yang di-
tumbuhkan pada media am kelapa terhadap jentik Cx. p. quinque-
fasciatus instar III, menunjukkan 9 isolat (100%) mempunyai
patogenisitas >50% (61,3100,0%) pada 24 jam pengujian dan
92,0100,0%, selama 48 jam pengujian. Uji patogenisitas 9
isolat B. thuringiensis yang ditumbuhkan pada media TPB,
terhadap jentik Cx. p. quinquefasciatus instar III, menunjukkan
5 isolat (55,56%) mempunyai patogenisitas > 50% yaitu 56,0
78,7% serta 4 isolat (44,44%) kurang dari 50% (40,048,0%)
pada 24 jam pengujian. Pada 48 jam pengujian, menunjukkan 7
isolat (77,78%) mempunyai patogenisitas > 50% (61,393,3%)
dan 2 isolat (22,22%) kurang dari 50% (46,748,0%). Tidak ada
perbedaan yang bermakna (p > 0,05) terhadap persentase ke-
matian jentik Cx. p. quinquefasciatus dari 9 isolat yang ditum-
buhkan pada media endosperm kelapa dan media TPB, maupun
antara media air kelapa dengan media TPB, pada 24 dan 48 jam
pengujian. Walaupun tidak ada perbedaan yang bermakna, akan
tetapi isolat-isolat yang ditumbuhkan pada media kelapa (air
kelapa dan endosperrnnya) menunjukkan patogenisitas tinggi
terhadap jentik Ae. aegypti dan Cx. p. quinquefasciatus, yaitu
lebih besar dari 50% pada 24 dan 48 jam pengujian. Begitu pula
pH yang tinggi (7,58,4) tidak berpengaruh pada aktivitas
larvisidanya.
Cermin Dunia Kedokteran No. 119, 1997 51
Tabel 2. Hasil uji patogenisitas isolat Bacillus thuringiensis yang ditumbuhkan pada berbagai media terhadap jentik Aedes aegypti
Instar
III
Kematian jentik nyamuk Ae. aegypti (%)****
24 jam
48 jam
I II I II
No. Lokasi
Habitat
tanab
Jumlah
sampel/
Isolat
Media
n
%
n %
1
Teluk Dalam Lubang pohon kweni
1/1
CE*
1 100,0
1 100,0
CW** 1 100,0
1
100,0
TPB*** 1 72,0
1 81,3
Bawah pohon kelapa
2/3
CE*
3 89,3100,0
3 100,0
CW** 3 100,0
3
100,0
TPB*** 3 80,093,3
3 93,3100,0
2
Bawonifaoso Lubang pohon kelapa
1/2
CE*
2 97,398,7
2 100,0
CW** 2 100,0
2
100,0
TPB*** 2 72,081,3
2 82,388,3
Bawah pohon kelapa
1/1
CE*
1 100,0
1 160,0
CW** 1 1.00,0
1
100,0
TPB*** 1 78,3
1 98,3
3
Legoksari
Lubang pohon trembesi
1/2
CE*
2 82,793,3
2 100,0
CW** 2 100,0
2
100,0
TPB*** 2 70,071,7
2 82,388,3
CE* 9 82,7100,0
9
100,0
Jumlah
6/9
CW**
9 100,0
9
100,0
TPB***
9 70,093,3
9
81,3100,0
Keterangan
: * =
Santan
kelapa (...) =
Persentase
kematian
jentik
** =
Air
kelapa
I =
Kematian
jentik
>
50%
***
=
Tryptose
Phosphate
Broth
II
=
Kematian
jentik
>
50%
**** =
Rata-rata
3
ulangan
Tabel 3. Hasil uji patogenisitas Isolat Bacillus thuringiensis yang ditumbuhkan pada berbagai media terhadap jentik Culex
quinquefasciatus
instar
III
Kematian jentik nyamuk Ae. aegypti (%)****
24 jam
48 jam
I II I II
No. Lokasi
Habitat
tanab
Jumlah
sampel/
Isolat
Media
n
% n % n % n %
1
Teluk Dalam Lubang pohon kweni
1/1
CE*
1 100,0
1 100,0
CW** 1 61,3
1
92,0
TPB***
1 56,0
1
62,7
Bawah pohon kelapa
2/3
CE*
3 65,3-80,0
3 80,0-100,0
CW** 3 100,0
3
100,0
TPB***
2 61,3-78,7 1
48,0
3
80,0-93,3
2
Bawonifaoso Lubang pohon kelapa 1/2
CE* 2 69.3-98,7
2
81,3-100,0
CW** 2 72,0-98,7
2
97,3-100,0
TPB***
1 71,7
40,0
1
82,3
1 46,7
Bawah pohon kelapa
1/1
CE*
1 100,0
1 100,0
CW** 1 100,0
1
100,0
TPB***
1 62,7
1
72,0
3
Legoksari
Lubang pohon trembesi
1/2
CE*
1 90,7
1 36,0
2 78,7-100,0
CW** 2 100,0
2
100,0
TPB***
2
40,0-44,0 1
61,3
1 48,0
CE* 8 65,0-100,0 1
36,0 9
78,7-100,0
Jumlah
6/9
CW**
9 61,3-100,0
9
92,0-100,0
TPB***
5 56,0-78,7
4
40,0-48,0 7
61,3-93,3
2 46,7-48,0
Keterangan
: * =
Santan
kelapa (...) =
Persentase
kematian
jentik
** =
Air
kelapa
I =
Kematian
jentik
>
50%
***
=
Tryptose
Phosphate
Broth
II
=
Kematian
jentik
>
50%
**** =
Rata-rata
3
ulangan
Bacillus thuringiensis varietas israelensis (H- 14) dapat
tumbuh dengan baik pada berbagai media kelapa, karena air ke-
lapa mengandung 2,2mg protein/ml, endosperm kelapa (santan)
1-4 mg protein/ml dan karbohidrat berkisar antara 638,4 mg/
ml
(13)
.
Bila dilihat dan persentase kematian jentik Ae. aegypti dan
Cermin Dunia Kedokteran No. 119, 1997
52
Cx. p. quinquefasciatus, maka ada perbedaan di antara isolat-
isolat yang diuji. Bacillus thuringiensis varietas israelensis (H14),
menunjukkan patogenisitas tinggi terhadap jentik nyamuk di-
bandingkan dengan 13 serotipe lain yang menunjukkan patogen
tinggi terhadap jentik Lepidoptera
(1)
. Karena itu uji serologi dari
isolat-isolat yang ditemukan akan dilakukan untuk mengetahui
serotipenya; tetapi sampai dengan saat ini uji serologi belum
dilakukan karena kesulitan memperoleh antisera.
Selain itu patogenisitas dapat dipengaruhi oleh kebiasaan
dan perilaku makan jentik, formulasi (khususnya tingkat pengen-
dapan/sedimentasi) serta adanya toksin di daerah makan jentik
(larval feeding zone)
(13,14)
. Berdasarkan faktor daerah makan
jentik dan tingkat sedimentasi/pengendapan, dapat diduga bahwa
toksin B. thuringiensis lebih banyak berada di dasar yang meru-
pakan daerah makan jentik Ae. aegypti daripada di bawah per-
mukaan air (suspension feeders) yang merupakan daerah makan
bagi jentik Cx. p. quinquefasciatus
(15)
.
Berbagai media kelapa (air kelapa dan endospermnya) dapat
digunakan untuk menumbuhkan isolat Bacillus thuringiensis.
1. WHO. Data sheet on the biological control agent Bacillus thuringiensis
serotype H-14. 1979. WHO/VBC/79.750.13p.
KESIMPULAN
Sejumlah 88,9% 100% dan 9 isolat yang ditumbuhkan
pada media air kelapa dan endosperm kelapa (santan) mem-
punyai patogenesitas > 50% terhadap jentik Ae. aegypti dan Cx.
p. quinquefasciatus instar III pada 24 dan 48 jam pengujian.
UCAPAN TERIMA KASIH
Kami mengucapkan terima kasih kepada Sustriayu Nalim, Pjh. Kepala
Stasiun Penelitian Vektor Penyakit yang telah membimbing dan memberi saran-
saran sehingga selesainya makalah ini Ucapan terima kasih juga kami sampai
kan kepada rekan-rekan di laboratorium jazad hayati SPVP atas bantuan yang
diberikan.
KEPUSTAKAAN
2. Soesanto. Prospek Bacillus thuringiensis dalam Pengendalian Hama.
Kumpulan Makalah Seminar B. thuringiensis. Komisi Pestisida Departe
men Pertanian. 1994; hal 114.
3. Chilcott CN, Wigley PJ. Technical note: an improved method for differen
tial staining of Bacillus thuringiensis crystals. Letters in Applied Micro
biology 1988; 7: 6770.
4. Yousten AA, Janes ME, Robert EB. Development of Selection/Differential
Bacteriological Media for the Enumeration of Bacillus thuringiensis
serovar israelensis (H-14) and Bacillus sphaericus 1593.1982.WHOIVBC/
82.844.
5. Dulmage HT. Production of deltaendotoxin by eighteen isolates of Bacillus
rhuringiensis scrotype 3, in three fermentation media. J Invertebrate Pathol
1971; 18: 35358.
6. Nagamma MV, Ragunathan AN, Majumder SK. A new medium for
Bacillus thuringiensis Berliner. J AppI Bacteriol 1972; 35: 36770.
7. Hertlein BC, Hornby J, Levy R, Miller TJ Jr. Prospects of spore forming
bacteria for vector control with special emphasis on their local production
protential. Document.1980.WHO/VBC/791pp.1 1.
8. Salama HS, Foda MS. Dulamge lIT, El-Sharaby A. Novel fermentation
media for production of delta endotoxins from Bacillus thuringiensis. J
Invertebrate Pathol 1983; 41: 819.
9. Obeta JAN, Okafor N. Medium for the production of primary powder of
Bacillus thuringiensis subspecies israelensis. AppI. Environment. Micro
biol 1984; 47: 86367.
10. Child R, Nathanael WRW. Changes in the sugar composition of coconut
water during maturation and germination. J Sci Food Agriculture 1950; 1:
32629.
11. Kuberski T, Roberts A, Lineham B, Bryden RN, TeburaeM. Coconut
water as a rehydration fluid. NZ Med J 1979; 190: 98100.
12. Pradera ES, Fernandez B, Calderin 0. A clinical and experimental study.
Am J Dis Child 1942:64: 97796.
13. AlyC, MullaMA, Bo-chaoXu, Schnetter W. Rate of ingestion by mosquito
larvae (Diptera, Culicidae) as a factor in the effectiveness of a bacterial
stomach toxin. J Med Entomol 1988; 25(3): 19196.
14. Chilcott CN, Pillai JS. The use of coconut wastes for the production of
Bacillus thuringiensis var. israelensis. 1985.
15. Becker N, Djakaria S, Kaiser A, Zulhasril O, Ludwig HW. Efficacy of a
new tablet formulations of an Asporogenous strain of Bacillus
thuringiensis israelensis against larvae of Aedes aegypti. Bull Soc Vector
Ecol 1991;
A fool may sometimes have talent, but he never has
judgement
(la Rochefouauld)
Cermin Dunia Kedokteran No. 119, 1997 53