Cermin Dunia Kedokteran

TEKNIK BARU

Perkembangan Teknik Hibridoma

Agus Sjahrurachman

Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta

PENDAHULUAN

Dalam kurun waktu puluhan tahun sejak Metchnikoff dan

Erhlich mengemukakan teori imunologi sehingga mendapatkan

hadiah Nobel 1908, banyak kemajuan yang telah dicapai baik

pada imunologi seluler maupun humoral

(1)

Sampai tahun 1975 walaupun imunologi khususnya imuno-

kimia telah cukup maju, antibodi yang digunakan untuk meng-

ikat atau mengenali suatu antigen masih dibuat dengan cara yang

konvensional yaitu mengimunisasi hewan percobaan, meng-

ambil darahnya dan mengisolasi antibodi dan serum sehingga

menghasilkan antibodi polikional. Dalani antibodi poliktonal

jumlah antibodi yang spesifik sangat sedikit, sangat heterogen

karena dapat mengikat bermacam-macam epitop dan antigen

yang diimunisasikan. Juga pembuatannya, dan awal pemurnian

antigen sampai menghilangkan antibodi yang tidak diinginkan

sangat memakan waktu dan su1it

(2)

Kohier dan Milstein (1975) memperkenatkan cara baru

membuat antibodi dengan mengimunisasi hewan percobaan, ke-

mudian sel limfositnya dihibridisasikan dengan biakan sel ter-

tentu sehingga hibrid dapat dibiakkan terus menerus (immortal)

dan membuat antibodi monoklonal

(2,3)

. Antibodi monokional

yang dibuat oleh sd hibrid mempunyai sifat tebih baik dan

antibodi polikionat karena hanya mengikat 1 epitop serta dapat

dibuat dalam jumlah tak terbatas

(2)

. Terobosan teknik hibnidoma

yang menghasilkan antibodi monoktonal terhadap antigen, mem-

buka era baru cara identifikasi dan niemurnikan suatu motekul

pada berbagai disiptin ilmu, juga membuka cakrawata dalam

prosedur diagnostik dan pengobatan dan pencegahan atternatif

pada keganasan dan berbagai penyakit lain

(4,5,6,7,8)

PRINSIP PEMBUATAN ANTIBODI MONOKLONAL

Tujuannya ialah menciptakan sel pembuat antibody homo-

gen yang dapat dibiakkan terus menerus (immortal), melalui :

1) Fusi sel limpa kebal dan sel mieloma

Pada kondisi biakanjaringan biasa, sel limpa yang

membuat antibodi akan cepat mati sedangkan sel mieloma

dapat dibiakkan terus menerus. Fusi sel dapat menciptakan sel

hibnd yang membuat antibodi seperti sel timpa dan dapat

dibiakkan terus menerus seperti sel mieloma

(9,10,11)

2) Eliminasi sel induk yang tidak fusi

Frekuensi terjadinya hibrid sel timpa-sel mieloma biasanya

rendah, karena itu penting untuk mematikan sel yang tidak fusi

yang jumlahnya lebih banyak agar sel hibrid mempunyai ke-

sempatan untuk tumbuh, dengan cara menggunakan:

(i) Sel mieloma mutan yang mempunyai kelainan (defect)

sintesis nukleotida yaitu sel mieloma yang tidak mempunyai

enzim timidin kinase (TK) atau hypoxanthine phosphoribosyt

transferase (HGPRT) sehingga dalam sintesis nukleotida tidak

dapat menggunakan salvage pathway dan

(ii)

Media selektif yang dikembangkan oleh Littlefield, me-

ngandung hypoxanthine, aminopterin dan thymidine (HAT).

Aminopteninmenghambatjalan biasa biosintesis purin dan piri-

midin sehingga memaksa sel menggunakan salvage pathway.

Sel yang tidak fusi karena tidak mempunyai enzim timidin kinase

atau hypoxanthine phosphonibosyttransferase akan mati, se-

dangkan sel hibrid karena mendapatkan enzim tersebut dan sel

mamalia yang difusikan dapat menggunakan salvage pathway

sehingga tetap hidup dan berkembang

(10,12)

3) Isotasi Mon yang diinginkan

Sel hibrid dikembang biakkan sedemikian sehingga tiap sel

hibrid akan membentuk kotoni sendiri. Tiap koloni kemudian

dipelihara terpisah satu sama lain. Hibridoma yang terbentuk di-

pilih dengan cara mendeteks antibodi yang disekresikan dalam

Cermin Dunia Kedokteran No. 104, 1995

medium. Kadarantibodi biasanyacukuptinggi(± 10100 u/ml),

sehingga banyak uji serologi yang dapat digunakan tergantung

jumlah antigen spesifik yang tersedia, tetapi yang paling sering

digunakan adalah radioimmunoassay (RIA) dan enzyme linked

immunosorbent assay (EL1SA)

(12)

4) Produksi antibodi monokional spesifik

Setelah klon hibridoma yang diinginkan dapat diisoiasi,

maka produksi antibodi monokional dapat dilakukan dengan

cara :

(i) in vitro, membiakkan pada medium biakan jaringan dan

antibodi dapat dipanen dan supernatan. Kadar pada umumnya

10100 ug/ml supernatan,

(ii) in vivo, mentranspiantasikan intraperitoneal pada binatang,

antibodi dipanen dan cairan asites. Kadar pada umumnya 1-25

mg/ml cairan asites

(10,12)

PERKEMBANGAN TEKNIK HIBRIDOMA

Sejak diperkenaikan, teknik hibridoma telah banyak

mengalami perkembangan untuk mendapatkan klon secara efisien

dan hibridoma yang hidup secara maksima

(13)

. Sejalan dengan

tujuan maka pengembangan timbul pada cara-cara:

1) Imunisasi

Hibridoma merupakan hasii fusi 2 sei yaitu sd mieioma dan

sel B penghasii antibodi. Karena itu supaya memperbanyak sel B

spesifik terhadap antigen yang diinginkan penting supaya popu-

lasi sel B pesifik jumlahnya lebih banyak sehingga hasil fusi

mencapai maksimal. Banyaknya sel B spesifik dipengaruhi anti-

gen baik caranya stimuiasi maupun sifat dan antigen sendiri, Se-

hingga untuk memperbanyak sel B spesifik, dilakukan berbagai

cara imunisasi, yaitu:

(i) Konvensional

Cara ini sebenarnya sama dengan cara imunisasi untuk

membuat antibodi poiikional. Antigen berupa protein atau poli-

sakanida dalam volume yang sama diemulsikan dengan complete

Freuncfs adjuvant, bila antigen seluier dibuat tanpa ajuvan.

Antigen disuntikkan subkutan pada beberapa tempat atau intra-

peritoneai, setelah 23 minggu disusul suntikan antigen tanpa

ajuvan secara intravena sekali atau beberapa kaii. Mencit dengan

tanggap kebal terbaik dipilih, 12 hari setelah suntikan terakhir

mencit dibunuh dan diambil sel limpanya

(11,12)

. Cara ini dianggap

cukup baik dan secara umum banyak dipakai, walaupun di-

pengaruhi sifat antigen berupa imunogen kuat atau lemah serta

tanggap kebal binatang yang berbeda-beda. Bila informasi anti-

gen yang iengkap tidak bisa didapatkan cara imunisasi ini ter-

bukti memberi hasil cukup baik

(11)

(ii) Imunisasi sekali suntik intralimpa (Single-shot intrasplenic

immunization)

Pada imunisasi konvensional, antigen dipengaruhi ber-

macam-macam faktor. Bila disuntikkan ke dalam darah sebagian

besar akan dibuang secaraaiami, sedangkan melalui kulit akan

tersaring kelenjar limfe regional, makrofag dan sel retikuler.

Hanya sebagian kecii antigen yang terlibat daiam proses tanggap

kebal. Pada hibridoma yang diperlukan adalah sel limpa, karena

itu untuk mencegah eiimin antigen oleh bagian lain dari tubuh

dilakukan suntikan imunisasi langsung pada limpa dan ternyata

hasilnya lebih baik dan cara konvensional

(14)

. Selain memberi-

kan hasil klon spesifik yang lebih banyak, imunisasi intraiimpa

ini memberi keuntungan yang lain : (1) Pemakaian antigen yang

sangat hemat, misalnya untuk imunisasi dengan 1gM manusia

hanya diperiukan 20 ug, sedangkan untuk antigen berupa sel

hanya diperlukan 200.000 sel, sehingga dapat dibuat hibridoma

dan antigen yang terbatas jumiahnya. Karena hampir semua

binatang percobaan membeni tanggap kebal yang baik, tidak di-

periukan binatang dalam jumlah yang besar

(14)

. (2) Fusi dapat

dilakukan dalam waktu 3 hari seteiah imunisasi

(14)

(iii) Imunisasi in vitro

Tidak ditemukannya antibodi monokional spesifik sering

karena kegagalan stimulasi limfosit B pada imunisasi in vivo. ini

mungkin disebabkan toleransi atau adanya antigen hierarchy

response (reaksi tanggap kebai hanya terhadap beberapa kom-

ponen antigen). Sering terjadi seteiah imunisasi dengan antigen

yang Iemah, wataupun titer antibodinya tinggi ternyata gagal

mendapatkan hibridoma spesifik karena rendahnya jumtah sel

B spesifik dalam limpa, maka untuk mengatasinya dilakukan

imunisasi in vitro

(15)

. Pada prinsipnya sel timpa belum imun

ditambah antigen dan TCM (thymocyte culture-conditioned

medium) yaitu medium biakan sel thymus setelah inkubasi 48

jam. Antigen dapat benupa antigen tertarut sebanyak 301000 ug

atau sel yang difiksasi aikohol atau yang diradiasi 4500 rad

dengan Cesium radioaktif. Setelah diinkubasikan 37°C selama 5

hari akan banyak dijumpai sel blast yang besar dan pada keadaan

ini sel siap untuk dilakukan fusi

(15)

Sebagai contoh kebenhasiian imunisasi in vitro : melalui

imunisasi in vitro dengan 107 sel acute myeloid leukemia (AML)

yang difiksasi alkohol, 31 dan 96 sumur biakan menghasilkan

hibridoma spesifik dan antibodi dan 6 dari klon ternyata sangat

spesifik karena tidak beneaksi dengan sel darah penifer maupun

sel sumsum tuiang. Hasil ini berbeda bila dibandingkan melalui

imunisasi in vivo, antibodi yang dihasiikan sebagian besar bereaksi

dengan major histocompatibility antigen atau major rnyeloid

differentiation antigen yang merupakan bagian terbanyak dari

permukaan sel

(15)

Perkembangan selanjutnya merupakan penyederhanaan kon-

disi imunisasi in vitro yaitu menggunakan medium yang biasa

untuk biakan jaringan yaltu RPMI (Roswell Park Memorial

Institute) atau DMEM (Dulbeco `s Mod Eagle's Medium) dan

ajuvan peptida yang mudah didapat, N-acetytmuramyl-L-alanyi-

D-isoglutamine. Cara ini terbukti telah meningkatkan jumlah

hibridoma pembuat antibodi sertajumlah hibridoma yang dapat

bertahan hidup. Pada pninsipnya cara ini sama dengan di atas,

yaitu sel limpa beium imun ditambah antigen dan 20 ug N-

acetylmuramyi-L-alanyi-D-iso- glutamine, diinkubasikan 37°C

dengan 5% CO

95% udara setama 4 hari

(16)

. Berhasilnya imu-

nisasi in vitro ini telah membuka petuang dilakukannya stimulasi

in vitro sel B manusia, karena imunisasi in vivo tidak dapat di-

jaiankan karena dibatasi etika, yang seianjutnya diikuti fusi

dengan sel mieloma manusia atau transformasi dengan virus

Epstein-Barr sehingga dapat dibuat antibodi monoktonat ma-

nusia

(16)

2) Pilihan sel mieloma

Cermin Dunia Kedokteran No. 104, 1995 53

Yang rnenjadi pertimbangan dalam memilih sel mieloma,

adalah:

a) Spesies

Sd mieloma yang berasal dari spesies yang sama dengan

binatang yang diimunisasi akan mengurangi segregasi kromo-

som pasca fusi. Contoh yang ekstrim ialah hibridoma sel mieloma

mencit dengan sel limpa manusia,kromosom sel manusia dengan

cepat mengalami segregasi sehingga hasil hibrid menjadi tidak

stabi1

(11,17)

. Dalam perkembangannya, pemilihan sel mieloma

yang berbeda spesies dapat dilakukan terutama untuk tujuan ter-

tentu. Hibrid sel mencit dengan tikus telah dibuat dan berhasil

baik, tetapi perbedaan spesies yang terlalu jauh dikatakan tidak

produktif

(18)

Walaupun pembuatan antibodi monokional mencitdan tikus

sudah berhasil baik, gunanya secara klinis sangat terbatas karena

tetap merupakan protein asing untuk manusia. Karena itu dikem-

bangkan hibrid manusia dengan mengembangkan sel mieloma

manusia yang sensitif terhadap hypoxanthinc-aminopterin-

thymidine. Tim dari Stanford University telah berhasil membuat

galur sel mieloma tersebut yaitu U-266 AR1 dengan nomor

registrasi SKO-007. Sayangnya galur ini masih membuat sendiri

IgE

(19)

b) Sintesis imunoglobulin

Sel hibridoma mengekspresikan rantai imunoglobulin se-

cara codominant, sehingga imunoglobulin dan sel mieloma akan

diekspresikan bersama imunoglobulin dan sel limpa dengan

kombinasi secara acak

(19)

. Sebagai contoh, bila sel mieloma

membentuk rantai berat dan rantai ringan imunoglobulin, seperti

juga halnya dengan sel limpa, maka imunoglobulin dan sel hibrid

merupakan kombinasi acak dari ke-4 rantai dan antibodi spesifik

hanya terdapat 1/16 dari seluruh imunoglobutin yang terben-

tuk

(20)

. Karena itu pengembangan diarahkan untuk membuat sel

mieloma yang tidak membuat rantai imunoglobulin tetapi tetap

dapat fusi dengan baik. Gatur sel mieloma mencit SP2/O-Ag14

yang merupakan hasil reclone SP2/HI-Ag adalah sel mieloma

pertama yang tidak membentuk rantai imunogtobutin

(20)

. Ber-

bagai jenis mieloma dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Galur sel mieloma

Galur

Spesies asal

Produksi Ig

P3-x63-Ag8 Mencit IgG

P3-NSI/I-A4-I Mencit Kappa

P3-x63-Ag8.653 Mencit

SP2/O-Ag 14

Fl0-RCY3-Agl

Mencit

Tikus

Kappa

Sumber 18.

3) Medium biakan

Medium biakan umumnya DMEM atau RPMI 1640 dengan

tambahan fetal calfserum (FCS) dan aditif lainnya. Yang menjadi

masalah adalah FCS harganya mahal, sutit didapat dan kuali-

tasnya sangat bervariasi tergantung sumbernya bahkan juga

bervariasi untuk tiap batch. Penambahan FCS sangat penting,

bahkan pada waktu fusi, seleksi dan cloning kadar FCS dalam

medium sering dinaikkan. Dipilih FCS karena kandungan

imunogtobulinnya rendah sehingga tidak mempengaruhi assay

serta sangat mendukung tumbuh dan kembang biak sel

(11)

Usaha pengembangan dilakukan untuk mendapatkan me-

dium tanpa serum karena memberi keuntungan:

memungkinkan penetitian yang tak memperbotehkan adanya

protein serum atau bahan-bahan dan serum misatnya hormon,

antibodi.

ekonomis, terutama untuk menumbuhkan sel dalam skala

besar.

mempermudah pemurnian antibodi monokional, bahkan

pada beberapa keadaan, antibodi monokional dapat langsung

digunakan tanpa pemurnian

(21)

. Salah satu dari medium tanpa

serum adalah Serum-free KSLM medium yang menggunakan

medium dasar RPMI 1640 + DMEM + Hams F-12 medium

dengan perbandingan 2: 1: 1, ditambah insulin, 2-amino etanol,

2-merkaptoetanot, natrium selenit, LDL manusia, asam oleat

dalam kompleks dengan albumin serum sapi (BSA)

(22)

. Serum-

free KSLM medium terbukti sama baiknya untuk menumbuhkan

sel mieloma NS- 1 dan sel hibnidoma (Tabet 2), dibandingkan

medium dengan 10% FCS. Harus menjadi perhatian bahwa tidak

semuajenis sel mieloma atau hibridoma cocok dengan medium

tanpa serum

(21)

Tabel 2. Hasil fusi mieloma dan sel limpa dalam medium KSLM dan

Medium

dasar

FCS

10%

(22)

Sumur (+) Ab terhadap A431

Induk mieloma

Kondisi

(%)

Koloni/sumur % sumur (+)

NS-I KSLM 54

12 25

NS-I

KSLM + FCS 10% 51

NS-I-503 KSLM

510 60

NS-1-503 MD+FCS

10%n

75 510 57

Keterangan :

KSLM

medium

tanpa

serum

medium

dasar

N 1-503 = varian dan sel NS-1 yang telah diadaptasikan pada medium

tanpa

lipid.

4) Fusi sel

Fusi sel diawali dengan fusi membran plasma sehingga

menghasitkan sel besar dengan dua atau lebih inti yang berasal

dari kedua induk sel yang berbedajenis, disebut heterokaryon,

pada waktu tumbuh dan membelah diri terbentuk 1 inti yang me-

ngandung knomosom kedua induk disebut sebagai sel hybrid

(17)

Frekuensi fusi dipengaruhi bermacammacam faktor:

jenis medium.

perbandingan jumtah sel timpa dengan sel mieloma.

jenis sel mieloma yang digunakan.

bahan yang mendorong timbulnya fusi (fusogen), misainya

polyethylene glycol

(23)

Secara garis besar fusogen dibagi menjadi 2 kategori:

Virus berselubung. Yang sering digunakan adalah virus

Sendai

(17,24)

Reagensia tipofitik atau tipolitik, misal lysole cithin dan

polyethylene g1ycol

(17)

Cermin Dunia Kedokteran No. 104, 1995

Pada awal penelitiannya Kohier dan Milstein menggunakan

virus Sendai yang inaktif sebagai fusogen

(3)

, tetapi karena sulit

menyiapkannya, efisiensinya sangat bervariasi dan hanya men-

dorong fusi pada beberapa jenis sel saja, maka fusogen diganti

dengan polyethylene glycol yang lebih mudah didapat dan dapat

mendorong fusi pada sel dengan jenis yang lebih luas

(17)

. Pengem-

bangan fusi sel banyak diarahkan untuk menaikkan efisiensi fusi

yang dianggap masih rendah, antara lain dengan cara:

mengembangkan fusogen

Polyethyleneglycol (PEG) secara luas sudah digunakan se-

bagai fusogen, biasanya dengan berat molekul 10006000, kon-

sentrasi 50%. Penambahan PEG dengan DMSO (dimethylsul-

phoxide) ternyata dapat menaikkan efisiensi fusi

(17)

mengembangkan teknik fusi lain,yaitu menggunakan medan

listrik pada limfoblas

(25)

5) Penumbuhan hibndoma

Berdasarkan pengamatan Fazekas de St Groth dan Schei-

degger, penumbuhan hibrid pasca fusi yang dilakukan dengan

feeder cell (sel limpa tidak imun) memberi hasil yang lebih

konstan dibanding tanpa feeder cell

(18)

. Sebagai feeder system

dapat digunakan sel limpa tidak imun, thymocyte, makrofag

peritoneum, fibroblas manusia yang telah diradiasi

(18)

, lipopoli-

sakarida (LPS), supernatan makrofag, supernatan biakan endotel

manusia dan serum darah tali pusat manusia

(13)

. Dalam feeder

system terdapat faktor pendorong penumbuhan sel, sebagai con-

toh:

mitogen lipopolisakarida (LPS), efeknya diperkuat dengan

penambahan dextran sufat.

supernatan makrofag mengandung monokin (interleukin-1)

menimbulkan aktivasi limfosit.

supernatan biakan endotel pembuluh darah manusia dapat

mendorong proliferasi dan diferensiasi hibridoma sel B, faktor

mitogennya sampai sekarang betum diketahui. Demikian juga

dengan serum tali pusat manusia yang sampai saat ini belum

diketahui faktor yang mendorong tumbuhnya hibridoma

(13)

Penambahan feeder system terbukti menaikkan frekuensi sel

limpa pembentuk klon dan frekuensi terbentuknya klon yang

membuat antibodi setelah fusi (Tabel 3)

(13)

Tibet 3. Efek berbagai Feeder system pada hibridoma

Sumur dengan klon Klon Ab (+)

Stimulator

Jumlah

sumur

biakan

(jumlah

fusi)

% jumlah

biakan

membentuk

klon

Frekuensi

sel

limps

% jumlah

biakan

membentuk

klon

Frekuensi

set

limps

CS 384

(4)

1.05

1.3

LPS + D x S 384 (4)

4.61

4.0

p. Makrofag

384 (4)

3.91

5.4

S 288

(3)

4.61

4.2

CA 384

(4)

4.61

4.0

Keterangan :

FCS

fetal

ca/f

serum

LPS + D x S = lipopolisakaridu + dextran cu/fat

HECS

supernatan

biakan

endotel,

manusia

HUCA = serum darah tali pusat manusia

KESIMPULAN

Hibridoma merupakan fusi sel limfosit B dengan sel mieloma,

yang dapat dibiakkan terus menerus. Karena hibridoma sel

limfosit B tetap mempertahankan ekspresi gen imunoglobulin

maka dimanfaatkan untuk membuat antibodi monoklonal.

Frekuensi timbulnya hibrid setelah fusi sangat rendah, karena itu

pengembangannya banyak diarahkan untuk menaikkan frekuensi

fusi dan mendapatkan klon hidup secara maksimal.

Cara imunisasi konvensional memberi hasil cukup baik,

tetapi cara imunisasi sekali suntik intratimpa dan in vitro mem-

beri hasil lebih baik, lebih hemat antigen serta waktunya lebih

singkat, bahkan imunisasi in vitro membuka peluang dilakukan-

nya imunisasi limfosit B manusia, dimana imunisasi in vivo tidak

dapat dilakukan karena dibatasi etika.

Pilihan sel mieloma makin beragam, baik spesies (mencit,

tikus, manusia) maupun sifatnya, makin ideal untuk membuat

antibodi monokional dengan dikembangkannya galur sel mieloma

yang tidak membentuk rantai imunogtobulin. Medium dasar

ditambah FCS (fetal calf serum) secara umum cukup baik, tetapi

FCS merupakan hambatan karena harganya mahal, sulit di-

dapatkan serta hasilnya bervariasi. Karana itu dikembangkan

medium tanpa serum sehingga penelitian yang perlu keadaan

tanpa serum dapat dilakukan dan biaya pemeliharaan sd dalam

skala besar akan lebih murah.

Untuk mendorong timbulnya fusi sel banyak digunakan

polyethyleneglycol (PEG) yang mudah didapat dan cukup efek-

tif. Pengembangan dilakukan untuk memperbaiki frekuensi fusi

dengan menambahkan DMSO bersama PEG dan penggunaan

medan listnik. Penambahan bermacam-macam feeder system,

terbukti dapat mendorong penumbuhan hibridoma.

KEPUSTAKAAN

1. Abba.s AK, Lichtman AH, Parker IS. (eds). Cellular and Molecular Immu-

nology. New York: WB. Saunders Co. 1991.

2. Mason DY. Cordell JL, Pulford KAF. Production of Monoclonal Anti-

bodies for lmmunocytochemical Use. Dalam Techniques in Immuno-

chemistry. ed. W.R. Bullock, Vol. 2. London: Academic Press 1983: hal.

175.-I 80.

3. KohlerG. Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody

of predifined specifity. Nature 1975; 256: 49597.

4. Di VT. Morrison SL. Chimeric antibodies. Biotechniques. 1986: 4(3):

21720.

5. Cotton RGH. Milstein C. Fusion of Two Immunoglobulin-producing

Myeloma cells. Nature 1973: 244: 423.

6. WinterG. Harris WI. Humanized antibodies. Immunology Today 1993: 14:

24346.

7. Waldman H, Colbold S. The use of monoclonal antibodies to achieve

immunological tolerance. Immunology Today 1993: 14: 2475 I.

8. Vitetta ES. Thorpe PE, UhrJW. Immunotoxins: Magic bullets or misguided

missiles. Immunology Today 1993: 14: 25259.

9. Harlow E. Lane ED. (eds). Antibodies A Laboratory Manual. New York:

Cold Spring Harbor PubI. 1988; hal 139281.

10. Cuello AC. Milstein C. Galfre G. Preparation and Application of Mono-

clonal Antibodies for Immunohistochemistry and Immunocytochemistry.

Dalam Methods in the Neurosciences. IBRO handbook series. 1983: Vol.

2. hal. 215223.

11. Galfie G Milstein C. Preparation of Monoclonal Antibodies : Strategies

and Procedures. Paper presented at WHO training course. Singapore. 1981.

12. Kearney IF. Hybridomas and Monoclonal Antibodies. Dalam Fundamental

Immunology. ed. W.E. Paul. New York: Raven Press. 4th ed. 1986: hal

Cermin Dunia Kedokteran No. 104, 1995 55

751754.

1980; 44: 542931.

13. Westerwoudt Ri. Factors Affecting Production of Monoclonal Antibodies.

Dalam Methods in Enzymology, ed. J.J. Lanone, H.V. Vunakis, Vol. 121.

Orlando: Academic Press. 1986; hal. 318.

20. Shulman M, Wilde CD, Kohler. A better cell line for making hybridomas

secreting specific antibodies. Nature. 1978; 276: 26970.

21. Kovar J, Franek F. Serum-Free Medium for Hybridoma and Parental

Myeloma Cell Cultivation. Dalam Methods in Enzymology,ed. J.J. Lanone,

H.V. Vunakis, Vol. 121. Orlando: Academic Press. 1986; hal. 27792.

14. Spitz M. "Single-Shot" Intrasplenic Immunization for the Production of

Monoclonal Antibodies. Dalam Methods in Enzyrnology, ed. J.i. Lanonø,

H.V. Vunakis, Vol. 121. Orlando: Academic Press. 1986; hal. 3341.

22. Kawamoto T, Sato JD, McClure DB, SatoGH. Serum-Free Medium for the

Growth of NS-1 Mouse Myeloma Cells and the Isolation of NS- I Hybrid-

omas. Dalam Methods in Enzymology, ed. J.J. Lanone, H.V. Vunakis, Vol.

121. Orlando: Academic Press. 1986; hal. 266277.

15. Reading CL. In Vitro Immunization for the Production of Antigen-Specific

Lymphocyte Hybridomas. Dalam Methods in Enzymology,ed. J.J. Lanone,

H.V. Vunakis, Vol. 121. Orlando: Academic Press. 1986; hal. 1927.

16. Boss BD. An Improved In Vitro Immunization Procedure for the Pro-

duction of Monoclonal Antibodies. Dalam Methods in Enzymology, ed.

J.J. Lanone, H.V. Vunakis, Vol. 121. Orlando: Academic Press. 1986; hal.

2733.

23. Mourik PV, Zeijiemaker WP. Improved Hybridoma Technology: Spleen

Cell Separation and Soluble Growth Factors. Dalam Methods in Enzymo-

logy, ed. J.J. Lanone, H.V. Vunakis, Vol. 121. Orlando: Academic Press.

1986; hal. 174175.

17. Kennett RH. Cell fusion. Dalam Methods in Enzymology. ed. W.B. Jakoby.

Vol. LVIII. Orlando: Academic Press. 1979; hal. 34559.

24. Joklik WK, Willett HP, Amos DB. Zinsser Microbiology. New York:

Appleton-Century-Croft 18th. ed. 1984; hal. 895896.

18. Hurrel JGR. Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Appli-

cations. Boca Raton: CRC Press Inc. 1985; 429.

25. Lane RD, Crissman RS, Ginn S. High Efficiency Fusion Procedure for

Producing Monoclonal Antibodies against Weak Immunogen. Dalam

Methods in Enzymology, ed. i.J. Lanone, H.V. Vunakis, Vol. 121.

Orlando: Academic Press. 1986; hal. 183184.

19. Olsson L, Kaplan HS. Human-human hybridomas producing monoctonal

antibodies of predefined antigenic specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

Cermin Dunia Kedokteran No. 104, 1995