Cermin Dunia Kedokteran

TINJAUAN KEPUSTAKAAN

Marine Toxin

Saxitoxin

Winarti Andayani*, Betty Marita Subrata**, dan Esther Budiman***

*Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan Radiasi, Badan Tenaga Atom Nasional, Jakarta

** Staf Pengajar Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, Bogor

*** Mahasiswa Program Pasca Sarjana Kimia, Universitas Indonesia, Jakarta

PENDAHULUAN

Pada umumnya orang berpikir dengan memakan seafood,

mereka akan mendapatkan keuntungan protein yang tinggi,

asam lemak omega-3 dan mineral, yang disertai dengan kan-

dungan lemak dan kalori yang rendah. Namun mereka menge-

tahui bahwa seafood juga bisa mengakibatkan keracunan

disebabkan oleh lingkungan yang tercemar. Tercemarnya

seafood dapat terjadi secara alami (mikroorganisme dan toksin)

maupun oleh kontaminasi bahan kirnia beracun.

Marine toksin (toksin yang terdapat di laut) sudah lama di-

identifikasi di berbagai tempat antara lain Jepang, Filipina, dan

Indonesia. Toksin ini sangat berbahaya dan tidak dapat rusak

oleh panas dan pemrosesan. Mereka berasal dari alam dan aki-

bat kegiatan manusia seperti limbah industri dan kebakaran

hutan, namun yang terpenting dari fitoplankton. Hampir semua

seafood bisa terkontaminasi oleh toksin dan dapat menim-

bulkan sindrom yang berbeda-beda (Gambar 1).

Toksin yang berasal dari plankton ditemukan juga dalam

kerang-kerangan. Hal ini karena kerang mempunyai sifat

penyaring makanan (filter feeding shellfish). Jumlah toksin

akan berlipat ganda sesuai dengan jumlah fitoplankton toksik

yang dimakannya. Toksin ini dapat menyebabkan paralytic,

neurotoxic, amnesic dan diarrhetic shellfish poisoning (PSP,

NSP, ASP, dan DSP), disamping itu mungkin juga dapat

memacu pertumbuhan tumor. Paralytic Shellfish Poisoning

disebabkan oleh saxitoxin yang tidak berpengaruh pada tubuh

kerang karena sudah kebal terhadap kondisi demikian setelah

lama berhubungan dengan toksin tersebut, tetapi dapat

berakibat kegagalan pernapasan yang fatal bagi manusia.

SAXITOXIN

Mikroalgae adalah produsen utama yang menyusun dasar

jaringan makanan laut dan air tawar. Banyak mikroalgae yang

Toxins

Marine dinoflagelates

(Also bacteria)

Toxins

Food chain

Fish

Shellfish

Ciguatera

Paralytic shellfish poisoning

Palytoxin

Neurotoxic shellfish poisoning

Puffer fish poisoning

Diarrhetic shellfish poisoning

Amnesic shellfish poisoning

(Diatoms)

Gambar 1. Beberapa Sindrom Akibat Keracunan Seafood

(1)

juga memproduksi komponen-komponen baru yang menunjuk-

kan aktivitas biologis yang kuat. Komponen-komponen ini di-

anggap sebagai metabolik sekunder, yaitu komponen yang

tidak esensial sebagai dasar metabolisme dan pertumbuhan

pada organisme, dan terdapat dalam kelompok taksonomi yang

terbatas. Biosintesis metabolit sekunder umum terjadi dalam

bakteri seperti dalam mikroba eukariotik dan tanaman.

Dari banyak metabolit sekunder algae yang telah di-

identifikasi, beberapa di antaranya merupakan toksin kuat yang

bertanggung jawab terhadap sejumlah penyakit pada manusia,

ketidaknormalan dan kematian hewan mamalia dan burung,

serta kematian ikan. Toksin yang terutama berarti bagi

kesehatan manusia berasal dari 3 kelas algae bersel satu, yaitu

dinoflagelata, diatoms dan cyanobacteria. Dinoflagelata mem-

Cermin Dunia Kedokteran No. 135, 2002 37

punyai jaringan yang luas, namun demikian hanya beberapa

lusin spesies, dari beberapa ribu spesies dinoflagelata yang

diketahui, kelihatan bersifat toksigenik. Pada diatoms, genus

tunggal, pseudo-nitschia, menghasilkan toksin yang memiliki

pengaruh kuat terhadap kesehatan manusia, sebaliknya pada

cyanobacteria hanya beberapa yang teridentifikasi menghasil-

kan toksin.

Toksin algae terdiri dari bermacam-macam berdasarkan

struktur dna fungsinya dan banyak yang merupakan turunan

dari jalur biosintesis yang unik. Misalnya dinoflagelata, men-

sintesis semacam toksin polieter yang terbagi atas dua grup

struktural linier dan gabungan (seperti tangga). Toksin algae

yang mempunyai pengaruh kuat terhadap kesehatan manusia

mungkin dikategorikan sebagai neurotoksin atau hepatotoksin.

Neurotoksisitas dari toksin algae diperantarai oleh bermacam-

macam interaksi yang sangat spesifik dengan saluran-saluran

ion yang terlibat dalam neurotransmisi.

Saxitoxin dihasilkan oleh beberapa spesies dinoflagelata

(2)

antara lain Alexandrium catenella, Alexandrium minutum,

Alexandrium tamarense, Gymnodium catenatum, dan Pyrodi-

nium bahamense var. compressum (Tabel 1). Beberapa spesies

dari genus Alexandrium, antara lain A. cohorticula dan A.

tamayavanichi, masih belum dapat dipastikan toksisitasnya

sehingga keberadaannya perlu diwaspadai. Ledakan populasi

(blooming) dari spesies-spesies tersebut di atas menyebabkan

perubahan warna air laut dari biru-biru menjadi merah

kecoklatan. Perubahan warna air laut ini umumnya dikenal

sebagai fenomena red tide. Fenomena red tide dapat dikaitkan

dengan beberapa fenomena alam seperti El Nino, yang ikut

menjadi penyebab red tide blooms di wilayah Indonesia.

Diperkirakan awal musim hujan merupakan masa-masa

terjadinya blooms dari spesies-spesies berbahaya yang ber-

tujuan untuk mengambil makanan dari daratan. Namun tidak

semua gejala red tide menyebabkan dampak negatif, bahkan

umumnya red tide terjadi sebagai tanda

Tabel 1. Plankton penghasil PSP

(2)

Spesies Areas

PSP

Components

Alexandrium

catenella

Pacific coasts-California, British

Columbia, Alaska, Japan,

Venezuela,

Chile

GTXs, STXs

A. tamarense

North Atlantic coasts-New

England, Canada, Denmark, W.

Germany, Holland, Norway,

Japan

GTXs, STXs

A. acatenella

British Columbia

unknown

A. phoneus

North Sea

unknown

A. cohorticula

Gulf of Thai

GTXs

Brunei, Papua New Guinea

unknow

Pyrodinium

bahamense

P. bahamense var.

compressa

Palau Island

GTXs, STXs

Gymnodinium

calenatum

Tasman Sea, Japan

PXs, GTXs

Cochlodinium sp. Japan Zn-bound

PXs

Aphanizomenon

flan-aquae

New England (lakes)

STXs

meningkatnya kesuburan suatu perairan. Red tide yang ber-

dampak merugikan disebut Harmful Algal Bloom (HAB).

Saxitoxin berupa cairan tidak berwarna dengan bau me-

nyengat (seperi asam cuka), dan mempunyai berat jenis 1,0

(g/mL) Saxitoxin bersifat racun dan menyebabkan iritasi apa-

bila kontak dengan kulit, mata, pernafasan dan mulut. Senyawa

ini mempunyai nilai LD

sebesar 263 g/kg bobot badan (oral

mencit).

Saxitoxin mempunyai sifat fisik larut dalam air dan metil

alkohol, sedikit larut dalam etil alkohol dan asam asetat tetapi

tidak larut dalam pelarut organik (non polar). Senyawa ini

mudah terhidrolisis dalam larutan basa dan toksinnya tidak

aktif setelah dididihkan selama 3 sampai dengan 4 jam pada pH

3. Racun PSP tidak dapat dihilangkan dari kerang-kerangan

baik melalui proses pemanasan maupun hidrolisis.

Struktur kristal dari komponen induk saxitoxin mula-mula

dilukiskan oleh Schantz dkk yang dapat dilihat pada Gambar

Pada Gambar 2 terlihat bahwa struktur dari congener

saxitoxin bervariasi, yang dibedakan oleh kombinasi substitusi

OH dan sulfat pada 4 sisi dalam molekul (Rl-4). Berdasarkan

substitusi pada R4, saxitoxin dapat dibagi atas 4 kelompok,

yaitu toksin karbamat, sulfo-karbamoil, dekarbamoil dan de-

oksikarbamoil. Adanya perbedaan substituen pada R4

STX H H H OCONH

2483

Neo

STX

H H OCONH

2295

GTX1

OSO3-

OCONH

2468

Carbamate

GTX2

H OSO3- H

OCONH

892

GTX3

H OSO3- OCONH

1584

GTX4

H OSO3- OCONH

1803

GTX5

(B1)

H H H OCONHSO3-

160

GTX6

(B2)

H H OCONHSO3-

H OSO3- H

OCONHSO3- 15

Sulfocarbamoyl

H OSO3- OCONHSO3- 239

OSO3-

OCONHSO3-

OH H OSO3- OCONHSO3- 143

dcSTX H H H OH

1274

dcNeoSTX

H H OH

dcGTX1

OSO3-

dcGTX2

H OSO3- H

1617

dcGTX3

H OSO3- OH

1872

dcGTX4

H OSO3- OH

doSTX H H H H

Deoxydecarbamoyl doGTX2 H

H OSO3- H

doGTX

H OSO3- H

Gambar 2. Struktur Saxitoxin dan Tosisitas Relatif dari PSP (van Dolah,

in press)

Cermin Dunia Kedokteran No. 135, 2002

mengakibatkan perubahan yang besar pada sifat toksisitasnya.

Toksin karbamat adalah yang paling kuat sifat toksisitasnya

(892-2483 mouse unit (MU) /

µmol). Toksin dekarbamoil mem-

punyai potensi di tengah-tengah yaitu 1274-1872 MU/

µmol dan

toksin sulfo karbamoil merupakan toksin yang paling lemah

(15-239 MU/

µnol). Nilai toksisitas ditentukan dalam satuan

Mouse Unit (MU), dimana 1 MU sama dengan jumlah toksin

yang dibutuhkan untuk membunuh seekor mencit seberat 20 g

dalam 15 menit.

PARALYTIC SHELLFISH POISONING (PSP)

Seafood yang telah terkontaminasi oleh saxitoxin apabila

dikonsumsi oleh manusia akan menyebabkan sindrom yang

disebut Paralytic Shellfish Poisoning. Gejala utama dari kera-

cunan saxitoxin adalah kelumpuhan (paralysis) pada otot,

selain otot jantung

(3)

. Penderita mula-mula akan merasakan

kesemutan dan mati rasa pada bibir yang menjalar ke seluruh

mulut dan leher. Gejala selanjutnya terasa pada ujung jari

tangan dan kaki yang nyeri seperti ditusuk-tusuk, pusing, mual,

muntah dan kejang pada otot perut, kesukaran bernafas dan

akhirnya berhenti bernafas, tetapi jantung masih tetap ber-

denyut. Bila tidak ditolong maka penderita akan meninggal

dalam waktu 24 jam. Pertolongan hanya dapat dilakukan

dengan cara menguras isi perut dan memberikan pernafasan

buatan.

Pada suatu penelitian sampel klinis dari terjangkitnya PSP

di Alaska tahun 1994, pembuangan saxitoxin dari darah manu-

sia berlangsung dalam waktu kurang dari 24 jam, juga pada

pasien yang mengalami kelumpuhan pernafasan dan dibantu

dengan bantuan pernafasan. Pembuangan ini sebagian besar

melalui urin. Saat ini masih belum tersedia penangkal untuk

PSP Antibodi monoklonal anti saxitoxin yang diuji secara in

vitro dan in vivo menunjukkan perlindungan terhadap terikat-

nya saxitoxin dan pengurangan gerakan di sekeliling saraf aki-

bat saxitoxin pada saraf mencit, diduga antibodi mungkin ber-

potensi menyediakan reagen yang berguna untuk perlindungan

terhadap toksisitas secara in vivo. Sebagai tambahan, peng-

halang saluran K, 4-aminoantipirin, baru-baru ini menunjukkan

pembalikan efek secara signifikan pada serangan saxitoxin

dalarn mencit, mungkin hal ini berguna sebagai penangkal bagi

PSP.

PENYEBARAN PLANKTON PENGHASIL PSP

Penyebaran dari mikroalgae dapat terjadi mengikuti bebe-

rapa pola, baik alami maupun karena kegiatan manusia. Dengan

demikian mikroalgae tersebut dapat terbawa oleh arus ke arah

tertentu dan apabila kondisinya sesuai, berkembang dengan

baik. Dengan perantaraan arus inilah umumnya mikroalgae me-

nyebar.

Di Jepang Alexandrium catenella pertama kali didapatkan

sebagai penghasil PSP di Owase Bay. Survey lain menunjukkan

bahwa spesies plankton ini secara luas terdistribusi di sebagian

besar bagian utara sampai bagian selatan Jepang

(2)

. Pyrodinium

bahamense var. compressum merupakan spesies utama penye-

bab PSP di perairan Indo-Pasifik, seperti di Papua Nugini,

Sabah, Brunei Darussalam, Filipina, Sarawak dan Semenanjung

Malaysia. Di Indonesia spesies ini sudah diidentifikasi dari

beberapa perairan, seperti Teluk Kao, Halmahera, Teluk

Ambon, Teluk Peru, perairan sekitar Biak, Teluk Jakarta, dan

Selat Bangka. Namun sampai seat ini masalah PSP hanya

dijumpai di perairan Teluk Kao dan Nunukan. Tempat penye-

baran plankton penghasil PSP dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Tempat penyebaran plankton penghasil PSP

(4)

Gejala PSP yang muncul di Jepang, teramati di Barat Daya

kepulauan Jepang. Terdapat paling sedikit 15 orang meninggal

akibat mengkonsumsi kepiting selama 1909-1988. Selama 20

tahun (1972 sampai dengan 1992), lebih dari 90% makanan

yang terkontaminasi oleh saxitoxin berakibat fatal. Jumlah kor-

ban mencapai 11.157 orang, dengan jumlah korban yang me-

ninggal sebanyak 271 orang.

Gejala PSP lainnya muncul di Taiwan bagian utara

(5)

Mereka melakukan penelitian di perairan Ilan County di Taipeh

dari bulan November 1996 sampai dengan Oktober 1997,

ternyata spesies Puffer takifugu rupripes telah terkontaminasi

oleh saxitoxin.

Di Indonesia PSP umumnya terjadi di perairan Teluk Kao,

Halmahera, Maluku. Di perairan sekitar Larantuka-Flores

Timor, gejala keracunan PSP telah tercatat semenjak tahun

1959 dengan korban tiga orang meninggal dan lima orang

mengalami kelumpuhan setelah memakan ikan laut. Kejadian

ini berulang pada tahun 1983, 1985, 1992, dan terakhir tahun

1997. Semua musibah terjadi pada awal musim penghujan,

sekitar bulan November-Desember. Musibah terparah terjadi

pada tahun 1983 dengan korban empat orang meninggal dunia

dan 236 orang mengalami kelumpuhan. Kejadian di Flores

Timor ini agak menyimpang dari kebiasaan, karena korban

jatuh setelah memakan ikan dan bukan kerang. Selain itu

sampai sekarang belum dapat ditentukan spesies mikroalgae

yang menghasilkan toksin PSP. Kesimpulan terjadinya kera-

cunan PSP hanya didasarkan pada gejala klinis penderita.

Lokasi lain di Indonesia yang mengalami kejadian PSP

tercatat di Kalimantan Timur, tepatnya di perairan Nunukan

dan Pulau Sebatik sebelah selatan, suatu pulau yang berbatasan

dengan Sabah. Kejadiannya berlangsung pada tahun 1988 se-

telah orang mengkonsumsi sejenis kerang, Merethrix merethrix

Cermin Dunia Kedokteran No. 135, 2002 39

(kerang tahu). Dua jam setelah memakan kerang, sebanyak 68

orang jatuh sakit dengan gejala PSP dan akhirnya 2 orang

meniggal dunia.

MEKANISME SAXITOXIN DI DALAM TUBUH

Berdasarkan aktivitas tiap molar senyawa, ternyata

saxitoxin paling aktif dalam menghambat (blocking) saluran-

saluran. dari susunan saraf den membran-membran sel jika

dibandingkan dengan senyawa-senyawa derivatnya yang lain.

Skema tahapan pengikatan saxitoxin terhadap saluran

natrium afinitas tinggi dapat dilihat pada Gambar 4, yang

menunjukkan bahwa ikatan ionik dari dari 7,8,9-guanidium ter-

hadap gugus anionik dari reseptor (A, B) menyebabkan

dehidrasi gemdiol pada posisi C-12, menghasilkan suatu keton

(Cl) yang terdapat dalam keadaan kesetimbangan yang cepat

dengan karbokation (C2). Ikatan kedua berupa ikatan kovalen

yang terbentuk di antara reseptor den C-12 (D).

Saxitoxin terikat dengan afinitas yang kuat pada reseptor

asetilkolin di saluran Natrium sehingga menghambat pem-

bukaan saluran. Polaritas molekul saxitoxin sebagian besar

menghambatnya untuk melintasi penghalang darah otak, karena

itu sisi utama tempat aksi saxitoxin pada manusia adalah

kemungkinan besar pada persimpangan otot saraf. Hal ini

sesuai dengan cepatnya serangan (kurang dari satu jam) dari

gejala yang klasik untuk PSP termasuk perasaan geli dan mati

rasa pada daerah-daerah perioral dan kaki tangan, kehilangan

kontrol motorik, perasaan mengantuk, berbicara tidak jelas, dan

pada kasus dengan dosis tinggi, terjadi kelumpuhan pernafasan

(sulit bernapas). Dosis letal untuk manusia adalah 1 - 4 mg

saxitoxin ekuivalen. Gejala klinis PSP terjadi bila kurang lebih

2000 MU (0,72 mg) termakan, dan kasus serius melibatkan

konsumsi 5.000-20.000 MU toksin (0,9-3,6 mg).

KEPUSTAKAAN

Tucker BW. Overview of Current Seafood Nutritional Issues : Formation

of Potentially Toxic Products. In : Seafood safety, Proccesing, and

Biotechnology. Shahidi F, Jones Y, and DD. Kitts (eds). A Technomic

Publishing Co. NY 1997

2. Takashi M. Recent Studies on Marine Toxins. Proceeding Fourth

LIPI-JSPS Joint Seminar on marine Sciences. Jakarta 1994; Hal 183-193.

3. Hashimoto

Marine Toxins and Other Bioactive Marine Metabolites.

Japan Scientific Societies Press. Tokyo 1977.

4. Van Dolah FM. Diversity of marine and Freshwater Algal Toxins. In

Seafood Toxicity. L. Botana (ed). Marcel Dekker. NY (in press)

Lin, SJ. Chai, T.J. Jong SS. and Deng Fwu Hwang. Toxicity of the Puffer

Takifugu Rubripes Cultured in Northern Taiwan. Fisheries Science 1998;

64 (5) : 766-770.

6. Kao YC and SR Levinson (eds). Tterodotoxin, Saxitoxin, and The

Molecular Biology of The Sodium Channel. The New York Academy of

Sciences. NY 1999.

AOAC Official Methods of Analysis Supplement. Natural Toxins 1995.

Chapter 49 : 46 B-48.

8. International Atomic Energy Agency. Regional Training Workshop on

Receptor Binding Assay Techniques for Harmful Algal Bloom Toxins

Quantification. Philippines 1999.

LAMPIRAN 1.

ANALISIS PSP DENGAN METODE BIOASSAY

(7)

Bahan

1. Larutan standar induk PSP 100

µg/mL (dalam alkohol yang telah

ditambah 20% asam), larutan ini stabil dalam tempat dingin (3-4

°C).

Larutan standar kerja PSP 1

µg/mL, dibuat dengan cara melarutkan 1 mL

larutan standar induk dalam 100 mL aquades, larutan stabil dalam beberapa

minggu pada 3-4°C.

Mencit sehat berukuran 19-21 g. Jika ukuran mencit < 19 g atau > 21 g

maka digunakan faktor koreksi untuk memperoleh waktu kematian yang benar.

Gambar 4. Tahapan Pengikatan Saxitoxin terhadap Saluran Natrium

(6)

Cermin Dunia Kedokteran No. 135, 2002

Pada analisis PSP mencit yang digunakan tidak boleh berukuran > 23 g, dan

tidak boleh digunakan berulang.

Standarisasi Bioassay

1. Sepuluh (10) mL larutan standar 1

µg/mL diencerkan dengan musing-

masing 10, 15, 20, 25, dan 30 mL aquades dan pH dikontrol antara 2-4.

Masing-masing 1 mL larutan disuntikkan secara intraperitoneal ke beberapa

ekor mencit dan kemudian dipilih larutan dengan konsentrasi yang memberikan

waktu kematian (death time) antara 5-7 menit.

2. Dari larutan dengan konsentrasi yang terpilih, masing-masing dibuat 3

ulangan dan disuntikkan 1 mL larutan secara intraperitoneal ke masing-masing

10 ekor mencit dan dicatat death time-nya.

3. Apabila ketiga ulangan dari sebuah larutan dengan konsentrasi yang

memberikan median death time lebih kecil dari 5 menit atau lebih besar 7

menit, maka hasil dari konsentrasi ini diabaikan. Sebaliknya, apabila salah satu

atau lebih dari sebuah larutan dengan konsentrasi yang memberikan median

death time antara 5 - 7 menit, maka hasil ini digunakan untuk perhitungan lebih

lanjut termasuk ulangan yang mungkin memberikan median death time lebih

kecil dari 5 menit atau lebih besar 7 menit.

4. Perhitungan nilai faktor koreksi (FK), nilai MU/ml ditentukan dari

median death time konsentrasi terpilih dengan menggunakan Tabel Sommer

yaitu hubungan antara death time terhadap MU untuk PSP (Lampiran 1). FK

dihitung dengan cara membagi konsentrasi terpilih (

µg/mL) dengan nilai

MU/ml. Nilai rata-rata FK yang diperoleh digunakan sebagai FK dalam analisis

sampel.

Persiapan Sampel

Bagian luar kerang-kerangan dicuci dengan air segar, kemudian dibuka

dengan alat khusus pemotong kerang, selanjutnya bagian dalam dibersihkan

dengan air bersih untuk menghilangkan pasir atau zat-zat asing lainnya. Bagian

daging (100 -150 g) diambil dan dikumpulkan (hindari penggunaan pemanasan

atau anestetik sebelum membuka kulit dan dilarang memotong atau merusak

badan pada tahapan ini).

Ekstraksi Sampel

Sampel sebanyak 100 gram ditambah 100 mL 0,1 N HCl, diaduk dengan

cepat dan diperiksa pH nya, jika perlu pH ditepatkan < 4. Campuran dipanaskan

dan dididihkan selama 5 menit, kemudian didinginkan pada suhu kamar.

Campuran yang sudah dingin ditepatkan pH nya pada pH 2 - 4 dengan

penambahan 5 N HCl atau 0,1 N NaOH setetes demi setetes sambil tetap

diaduk. Sampel ditepatkan di dalam gelas piala sampai homogen atau jika

diperlukan sampel disentrifugasi selama 5 menit pada 3000 rpm kemudian

disaring melalui kertas saring. Filtrat diambil untuk pengujian pada mencit.

Pengujian Mencit

Setiap mencit disuntik secara intraperitoneal dengan 1 mL ekstrak. Waktu

suntikan dicatat dan mencit diamati dengan hati-hati untuk mengetahui death

time nya yang ditunjukkan oleh hembusan nafas terakhir. Satu mencit boleh

digunakan untuk penentuan awal, tetapi pengujian menggunakan 2 atau 3

mencit lebih baik. Jika death time dari beberapa mencit < 5 menit, maka perlu

dibuat pengenceran sampel untuk memperoleh death time 5 - 7 menit. Jika

death time dari 1 atau 2 mencit yang disuntik dengan sampel yang tidak

diencerkan > 7 menit, maka paling sedikit 3 mencit harus disuntik untuk

memastikan toksisitas dari sampel. Jika pengenceran besar diperlukan, maka

pH sampel harus ditepatkan lagi antara 2 - 4. Sebanyak 3 mencit disuntik

dengan larutan yang sudah diencerkan sampai memberikan death time 5 - 7

menit.

Penghitungan Toksisitas

Waktu death time ditentukan, termasuk yang selamat, dan dari Tabel

Sommer ditentukan bilangan MU. Jika beret mencit yang diuji < 19 g atau > 21

g, maka dibuat FK untuk setiap mencit dengan mengalikan MU terhadap death

time mencit. Nilai MU diubah ke

µg racun/mL dengan mengalikan FK.

µg racun/100 g daging = (µg/mL) x faktor pengenceran x 200

Nilai > 80 g/100 g merupakan indikasi bahwa sampel yang diuji sangat racun

dan tidak aman untuk dikonsumsi.

ANALISIS PSP DENGAN METODE SAXITOXIN BERTANDA

(8)

Peralatan

Mikropipet berukuran 1 1000

µL

2. Pipet multi channel berukuran 5 200

µL.

3. Plate mikrotiter dengan 96 lubang

4. Tabung sentrifugasi 15 dan 30 mL

5. Vortex

Bahan Kimia

1. [

H] STX diasetat

2. STX dihidroksi HCl

(Lihat halaman berikutnya)

LAMPIRAN 2.

Tabel Sommer (AOAC,1995)

DT MU DT MU DT MU DT MU

1.00 100 3.00 3.70 5.00 1,92 9.00 1,16

1.10 66,2 3.05 3,57 5.05 1,89 9.30 1,13

1.15 38,3 3.10 3,43 5.10 1,86 10.00 1,11

1.20 26,4 3.15 3,31 5.15 1,83 10.00 1,09

1.25 20,7 3.20 3,19 5.20 1,80 11.00 1.075

1.30 16,5 3.25 3,08 5.30 1,74 11.30 1.06

1.35 13,9 3.3e 2,98 5,40 1,69 12.00

1.05

1.40 11,9 3.35 2,88 5,45 1,67 13.00 1.03

1.45 10,4 3

40 2,79 5.50 1,64 14.00 1.015

1.50 9,33 315 2,71 6.00 1,60 15.00

1.000

1.55 8,42 3.50 2,63 6.15 1,54 16.00 0,99

2.00 7,67 3.55 2,56 6.30 1,48 17.00 0,98

2.05 7,04 4.00 2,50 6.45 1,43 18.00

0,972

2.10 6,52 4.05 2,44 7.00 1,39 19.00 0,965

2.15 6,06 4.10 2,38 7.15 1,35 20.00 0,96

2.20 5,66 4.15 2,32 7.30 1,31 21.00 0,954

2.25 5,32 4.20 2,26 7.45 1,28 22.00 0,948

2.30 5,00 4.25 2,21 8.00 1,25 23.00 0,942

2.35 4,73 4.30

2,16 8.15 1,22 24.00

0,937

2.40 4,48 4.35 2,12

8.30 1,20 25.00 0,934

2.45 4,26 4.40 2,08 8.45 1,18 30.00 0,917

2.50 4,06 4.45 2,04

40.00 0,898

2.55 3,88 4.50 2,00

60.00 0,875

4.55

1,96

Keterangan :

DT : death time dalam mencit

MU : mouse unit

LAMPIRAN 3.

Tabel Sommer (AOAC, 1995)

WM MU WM MU

10 0,50

17 0,88

10,5 0,53 17,5 0,905

11 0,56

18 0,93

11,5 0,59 18,5 0,95

12. 0,62 19 0,97

12,5 0,65 19,5 0,985

13 0,675

20 1,000

13,5 0,70 20,5 1,015

14 0,73

21 1,03

14,5 0,76 21,5 1,04

15 0,785

22 1,05

15,5 0,81 22,5 1,06

16 0,84

23 1,07

16,5 0,86 -

Keterangan :

WM : berat mencit (gram)

MU : mouse unit

Cermin Dunia Kedokteran No. 135, 2002 41

(Lanjutan Lampiran 1)

STX binding buffer =75 mM HEPES + 140 mM NaCI buffer pH 7,5

Rat brain synaptosome

Cara Kerja

Pengenceran larutan baku [

H] STX dalam tabung 15 mL, 3

µL [

H] STX

3,8 mL STX binding buffer, 35

µL [

H] STX yang telah diencerkan

dimasukkan dalam vial dengan scintilant dan di-counting dengan alat

scintilation counter untuk memperoleh total count (cpm).

2. Persiapan kurva standar STX menggunakan STX dihidroksi HCl dalam

tabung dengan berbagai konsentrasi, yaitu 6 x 106

-6

; 6 x 10

-7

; 6 x 10

-8

; 6 x 10

-9

;

6 x 10

-10

3. Pengenceran

rat brain synaptosome murni dalam STX binding bufer.

Jaringan dalam larutan 2 mL diencerkan dengan perbandingan 2 : 10 (2 mL

jaringan + 18 mL buffer) dalam tabung sentrifugasi 50 mL, sampai didapatkan

konsentrasi akhir 0,5 1,0 mg/mL.

4. Ekstrak sampel kerang yang diduga terkontaminasi STX diencerkan

dengan binding buffer.

Masing-masing sebanyak 35

µL sampel dan standar STX dimasukkan ke

dalam plate mikrotiter, ditambah dengan 35

µL, [

H] STX dan 140

µL rat

brain sinaptosome yang telah diencerkan. Campuran ditutup dan diinkubasi

pada 4

°C selama 1 jam. Toksin yang tidak terikat oleh jaringan dihilangkan

dengan cara pencucian menggunakan buffer yang dilanjutkan dengan aseton,

kemudian disaring.

6. Masing-masing residu dimasukkan ke dalam vial yang telah berisi 1 mL

larutan scintilator dan di-count,dengan alat scintillator counter untuk

memperoleh total count (cpm).

Cara Perhitungan

Total count dari larutan standar STX dibuat kurva kalibrasi, log STX

terhadap total count (cpm). Dengan mengetahui nilai total count sampel, maka

konsentrasi STX dalarn sampel dapat dihitung. Konsentrasi sampel dihitung

dalam

µg STX equivalen/100 shellfish, menggunakan rumus sebagai berikut :

nM equiv STX dalam ekstrak = nM equiv STX x pengenceran sampel x (V

total/ 35

µL)

µg STX equivalen/mL = nM equiv STX dalam ekstrak x (1 L/1000 mL) x

(372 ng/mmol) x 1

µg / 1000 ng)

µg STX equivalent/100 g shellfish = µg STX eqaivalen/mL x (mL ekstrak

/ g shellfish) x 100

Cermin Dunia Kedokteran No. 135, 2002