HASIL PENELITIAN
Aktivitas Antimalaria
Senyawa Tinokrisposid
secara in vivo
1.
Adek Zambrut A*, Desy M. Gusmali**, M. Husni Mukhtar*
* Jurusan Farmasi, FMIPA, Universitas Andalas, Padang
**Pusat Penelitian dan Pengembangan Farmasi, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan
Departemen Kesehatan Rl, Jakarta.
ABSTRAK
Telah dilakukan pemeriksaan aktivitas antimalaria senyawa tinokrisposid, suatu
furanoditerpenglikosida baru dari batang Tinospora crispa (L) Miers ex Hook F. &
Terms (brotowali) terhadap perkembangan Plasmodium berghei (ANKA) pada mencit
putih jantan galur Swiss. Penelitian ini dilakukan secara in vivo dengan dua cara: I)
Cara dosis tunggal yaitu suspensi senyawa tinokrisposid diinjeksikan dulu ke dalam
tubuh mencit, 30 menit kemudian baru diinjeksikan darah donor yang mengandung
Plasmodium berghei. II) Cara dosis ganda yaitu mencit diinjeksi dulu dengan darah
donor yang mengandung P. berghei, 24 jam kemudian baru diinjeksikan suspensi
senyawa tinokrisposid. Pengamatan dilakukan terhadap persentase parasitemia mencit
dengan membuat preparat sediaan darah tebal dan preparat sediaan darah lapis tipis
dari darah mencit uji.
Selain itu diamati waktu kematian masing-masing mencit. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa senyawa tinokrisposid dapat menekan perkembangan P. berghei
dalam darah mencit uji secara sangat bermakna (P<0,05). Efek optimal dicapai pada
dosis 44 mg/kg bb.
PENDAHULUAN
Tumbuhan merupakan salah satu sumber senyawa kimia
baru yang penting, baik sebagai obat maupun sebagai senyawa
model untuk mendapatkan senyawa aktif barn
(1)
.
Tumbuhan brotowali (Tinospora crispa) telah lama di-
gunakan untuk pengobatan. Kemudian diinformasikan bahwa
ekstrak kasar tumbuhan ini berkhasiat sebagai antimalaria,
antipiretika, antidiabetes, antiinflamasi dan analgetik
(1,2,3)
. Tino-
spora crispa mengandung zat pahit tinokrisposid dan beberapa
alkaloid seperti aporfin, berberin dan palmatin
(1,4)
. Hasil
pemeriksaan efek farmakologi senyawa tinokrisposid ber-
khasiat sebagai analgetik, koagulansia, antiinflamasi dan anti-
diabetes
(5)
.
Senyawa tinokrisposid adalah suatu senyawa sangat pahit
yang mempunyai struktur furanoditerpenglikosida. Struktur ini
mirip dengan struktur senyawa nimbolid yang mempunyai efek
antimalaria
(4,6)
.
Malaria merupakan salah satu penyakit yang disebabkan
oleh parasit. Penyakit ini telah lama dikenal dan paling luas
penyebarannya terutama di daerah tropis. Sejak tahun 1956,
WHO telah melaksanakan program pemberatasan penyakit
malaria secara intemasional dan hasilnya sangat memuaskan
sampai tahun 70-an, tetapi belakangan ini penyakit malaria
kembali meluas, disebabkan oleh munculnya galur plasmodium
yang resisten terhadap obat-obat malaria yang ada
(7,8,9)
.
Gambar 1. Struktur tinokrisposid
Telah dibawakan pada acara seminar Perhipba tanggal 22 Juli 1999.
Rektorat UI Lt. 8, Jakarta
Cermin Dunia Kedokteran No. 131, 2001
27
Gambar 2. Struktur nombolid
Untuk mengatasi masalah di atas, dilakukan berbagai usaha
pencarian obat baru, baik dari obat tradisional, obat sintetis,
maupun pembuatan vaksin antimalaria
(10)
.
Berdasarkan informasi tentang struktur tinokrisposid dan
khasiat brotowali secara tradisional sebagai antimalaria, maka
dilakukan penelitian efek senyawa tinokrisposid terhadap
malaria.
METODE PENELITIAN
Alat
Mikroskop binokuler, kaca objek, timbangan hewan, tim-
bangan obat, tempat hewan, tabung reaksi berisi Na. EDTA,
spuit & jarum suntik, lumpang & stanfer, pipa kapiler, kapas,
kertas pH, label.
Bahan
Hewan. percobaan mencit putih jantan galur swiss, Plas-
modium berghei (ANKA), senyawa uji tinokrisposid, air suling,
Na. CMC, Metanol 95%, tablet buffer (mengandung Dinatrium
hidrogen fosfat 0,7 g dan Kalium dihidrogen fosfat 1,0 g),
pewarna Giemsa, minyak imersi, eter anestetik.
Prosedur penelitian :
Senyawa uji tinokrisposid hasil isolasi dari brotowali oleh
Adek Zambrut Adnan, dari laboratorium Kimia Bahan Alam
Jurusan Farmasi UNAND, Padang. Kemudian dilakukan peme-
riksaan kemurnian terhadap senyawa tersebut, yang meliputi
pemerian, kelarutan, identifikasi dengan spektrofotometri yang
meliputi pemeriksaan spektrum UV dan IR.
Mencit yang digunakan dalam uji antimalaria diinfeksi
dengan menggunakan darah mencit donor yang mengandung P.
berghei. Mencit donor didapatkan dengan menginjeksikan 0,2
ml darah yang mengandung parasit secara i.p yang sebelumnya
diawetkan pada suhu -70°C atau dalam nitrogen cair terhadap 5
ekor mencit, kemudian dipelihara selama 5 hari. Dilakukan
pemeriksaan persentase parasitemia darah mencit donor dengan
membuat preparat darah tebal dan preparat darah lapis tipis. Sel
darah merah yang terinfeksi di bawah mikroskop dilihat dan
dihitung.
Darah terinfeksi dari mencit donor diambil dari mata
sebanyak 1-l,5 ml menggunakan pipa kapiler yang mengandung
zat antikoagulan, kemudian darah ditampung dalam tabung
reaksi yang berisi larutan Na. EDTA 0,05%. Darah donor yang
didapat lalu diinjeksikan pada mencit normal sebanyak 0,1 ml
secara i.p, lalu mencit dipelihara selama 5 hari untuk selanjut-
nya diambil darahnya yang akan digunakan sebagai sumber
plamodium uji antimalaria
(11)
.
Mencit yang dinilai sehat digunakan dalam percobaan,
berat badan mencit 20-15 g. Selama pemeliharaan perubahan
bobot badan hewan tidak melebilti 10% dan secara visual
menunjukkan perilaku normal
(12)
.
Mencit yang telah mengalami adaptasi dipilih sebanyak 42
ekor. 21 ekor dipakai untuk cara dosis tunggal dan 21 ekor lagi
dipakai untuk cara dosis ganda. Untuk cara dosis tunggal dari
21 mencit dibagi 7 kelompok yang masing-masingnya 3 ekor
mencit. 1 Kelompok digunakan sebagai kontrol yang diinjeksi
dengan larutan pensuspensi Na. CMC 0,5% b/v sebanyak 0,1%
berat badan dan 6 kelompok lagi diinjeksi dengan suspensi
senyawa tinokrisposid masing-masingnya dengan dosis 15
mg/kg bb, 22 mg/kg bb, 30 mg/kg bb, 44 mg/kg bb, 62 mg/kg
bb, 90 mg/kg bb; 30 menit kemudian diinjeksi dengan darah
mencit donor yang mengandung P. berghei. Setelah 24 jam
dibuat preparat sediaan darah tebal dan preparat darah lapis
tipis. Sel darah merah yang terinjeksi dilihat dan dihitung di
bawah mikroskop. Kemudian diamati hari kematian masing-
masing mencit.
Untuk cara dosis ganda 21 ekor mencit dibagi atas 7
kelompok masing-masing 3 ekor mencit. Tiap-tiap kelompok
diinjeksi dengan darah mencit donor yang mengandung P.
berghei. Setelah 24 jam dibuat preparat sedian darah tebal dan
preparat sediaan darah lapis tipis; dihitung persentase para-
sitemianya. Satu kelompok digunakan sebagai kontrol dengan
larutan pensuspensi Na. CMC 0,5% b/v sebanyak 0,1% berat
badan dan 6 kelompok lagi diinjeksi dengan suspensi senyawa
tinokrisposid masing-masing dengan dosis 15 mg/kg bb, 22
mg/kg bb, 30 mg/kg bb, 44 mg/kg bb, 62 mg/kg bb, 90 mg/kg
bb, sekali perhari selama 3 hari berturut-turut. Sebelum
pemberian suspensi tinokrisposid berikutnya diperiksa dan
dihitung dulu persentase parasitemia darah mencit dengan
membuat sediaan preparat darah tebal dan sediaan preparat
darah lapis tipis sampai hari ke-4, yang dilihat dibawah mikros-
kop. Kemudian diamati hari kematian masing-masing mencit.
Pengolatan Data
Data diolah secara stastistik menggunakan Analisis Varian
Satu Arah, alas data cara dosis tunggal dan data hari ke-4 pada
cara dosis ganda. Uji Newman Keuls (SNK) dilakukan untuk
melihat perbedaan antar kelompok serta melihat keefektifan
senyawa tinokrisposid tersebut
(13)
.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Senyawa tinokrisposid didapatkan berupa kristal jarum
halus warna putih, rasa pahit, sukar larut dalam air, larut dalam
etanol, metanol dan kloroform. Hasil identifikasi dengan spek-
trofotometer UV dan IR sesuai dengan literatur dapat dilihat
pada Tabel 1, Gambar 3-6.
Cermin Dunia Kedokteran No. 131, 2001
28
Tabel 1. Hasil Pemeriksaan Senyawa Tinokrisposid
Data Pustaka
(4)
Pengamatan
Pemeriksaan
Kristal jarum halus
Warna putih
Rasa sangat pahit
Kristal jarum halus
Warna putih
Rasa sangat pahit
Kelarutan
Sukar larut dalam air,
larut dalam etanol ,
metanol dan kloroform.
Memenuhi syarat
Identifikasi
Spektrum UV
maks. 21 lnm
Spektrum IR
Spektrum UV
mas. 219,8
Spektrum IR
Serapan Oh = 3400 cm
-1
Serapan Oh = 3400 cm-'
CH = 3160 cm-'
CH = 3160 cm-'
C=0 ester = 1710 cm-'
C=0 ester = 1710 cm-'
Gambar 3. Spektrum ultraviolet senyawa tinokrisposid dalam pelarut
metanol
Pada penelitian pendahuluan untuk menentukan dosis yang
akan digunakan diperoleh dosis terkecil yang memberikan efek
adalah 15 mg/kg bb dan dosis terbesar adalah 90 mg/kg bb.
Untuk menentukan kenaikan dosis digunakan rumus Malon
Robinchaud
(14)
.
Senyawa tinokrisposid memberikan pengaruh menghambat
pertumbuhan P. berghei. Secara umum hasil yang diperoleh
baik pada cara dosis tunggal maupun pada cara dosis ganda
adalah sama, yaitu efek optimal pada dosis 44 mg/kg bb.
(Tabel 2.3 dan Gambar 7.8).
Ternyata persentase parasitemia semua kelompok perlaku-
an baik yang diberi suspensi senyawa tinokrisposid dan kelom-
pok kontrol tetap ada dan cenderung terns meningkat.
Kematian mencit percobaan terjadi mulai hari ke-6 dan
seluruh mencit percobaan mati pada hari ke-15. (Tabel 4 dan
Tabel 5).
Pada penelitian ini tidak digunakan obat umum yang biasa
digunakan untuk mengobati malaria pada manusia, karena
penelitian ini ditujukan sebagai uji pendahuluan untuk melihat
indikasi senyawa tinokrisposid sebagai antimalaria. Selain itu
belum diketahui pada face apa senyawa ini bekerja terhadap P.
berghei.
Gambar 4. Spektrum ultraviolet senyawa tinokrisposid dalam pelarut
metanol dari literatur
(4)
.
Sampel : Tinokrisposid
Sumber : -
Spektrum NR : -
Fase : KBr
Konsentrasi : -
Pelarut : -
Tebal lapisan : -
Referensi : -
Catatan :
Nama : Drs. Mahyuddin
Tanggal : 25-4-1995
Gambar 5. Spektrum inframerah senyawa tinokrisposid dalam pellet KBr.
Gambar 6. Spektrum inframerah senyawa tinokrisposid dalam pellet
KBr
dari literattur
(4)
Cermin Dunia Kedokteran No. 131, 2001
29
Tabel 2.. Hasil penentuan rata-rata persentase parasitemia P. berghei
(ANKA) dari mencit dengan pemberian senyawa tinokrisposid
dosis tunggal.
Dosis
(mg/kg BB)
Parasitemia
(%)
K 1,71
15 1,69
22 1,22
30 0,95
44 0,68
90 1,61
Keterangan :
K = Kontrol terinfeksi P. berghei (ANKA) tanpa diobati
Jumlah eritrosit terinfeks
(%) Parasitemia =
x 100%
1000
eritrosit
Tabel 3. Hasil penentuan rata-rata persentase parasitemia mencit dengan
pemberian senyawa sinokrisposid sosis sanda
Dosis Parasitemia
(%)
(mg/kg BB)
h
0
h
1
h
2
h
3
K 1,89
9,99
28,12
48,32
15 1,79
8,91
15,96
20,95
22 1,77
7,95
14,79
18,56
30 1,90
6,60
11,61
17,35
44 1,74
5,20
10,16
13,54
62 1,86
7,38
14,95
17,22
90 1,84
9,18
18,04
21,73
Keterangan :
K = Kontrol terinfeksi P. berghei (ANKA) tanpa diobati
H
0
= Hari 0 persentase parasitemia mencit sebelum diberi senyawa
tinokrisposid.
h
1
= Hari 1 persentase parasitemia mencit sesudah pemberian senyawa
tinokrisposid ke 1.
h
2
= Hari 2 persentase parasitemia mencit sesudah pemberian senyawa
tinokrisposid ke 2.
h
3
= Hai 3 persentase parasitemia mencit sesudah pemberian senyawa
tinokrisposid ke 3.
Jumlah eritrosit terinfeksi
(%) Parasitemia =
x 100%
1000
eritrosit
Gambar 7. Histogram hubungan dosis dengan persentase parasitemia
(Metode dosistunggal)
Keterangan :
K = Kontrol terinfeksi P. berghei (ANKA) tanpa diobati
Gambar 8. Histogram Hubungan Dosis dengan Persentase Parasitemia
(Metode Dosis Ganda)
Keterangan :
K = Kontrol terinfeksi P. berghei (ANKA) tanpa diobati
h
0
= Hari 0 persentase parasitemia mencit sebelum diberi senyawa
tinokrisposid.
h
1
= Hari 1 persentase parasitemia mencit sesudah pemberian senyawa
tinokrisposid ke 1.
h
2
= Hari 2 persentase parasitemia mencit sesudah pemberian senyawa
tinokrisposid ke 2.
h
3
= Hai 3 persentase parasitemia mencit sesudah pemberian senyawa
tinokrisposid ke 3.
Jumlah eritrosit terinfeksi
(%) Parasitemia =
x 100%
1000
eritrosit
Tabel 4. Hasil pengamatan lama hidup mencit terinfeksi P. Berghei
(ANKA) dengan pemberian senyawa tinokrisposid dosis tunggal.
Hari Kematian Hewan
Dosis
(mg/kg BB)
No.
Hewan 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
*
*
K
1
2
3
*
*
*
15
1
2
3
*
*
*
22
1
2
3
*
*
*
30
1
2
3
*
*
*
44
1
2
3
*
*
*
62
1
2
3
*
*
*
90
1
2
3
*
Keterangan :
* = Hewan mati
K = Kontrol terinfeksi P. berghei (ANKA) tanpa diobati
Cermin Dunia Kedokteran No. 131, 2001
30
yaitu depresan
(15)
. Kemungkinan kedua disebabkan oleh peng-
aruh farmakokinetik senyawa tinokrisposid yang sifat fisiknya
tidak larut dalam air akan mempengaruhi absorbsi, distribusi,
metabolisme dan eksresi. Kemungkinan ketiga adalah pengaruh
enzim metabolisme; tinokrisposid pada dosis kecil belum bisa
menginduksi enzim metabolisme sehingga senyawa tinokris-
posid tetap aktif menghambat P. berghei, sedangkan pada dosis
yang lebih besar tinokrisposid akan menstimulasi enzim meta-
bolisme, mengakibatkan senyawa tinokrisposid akan terurai,
teroksidasi atau terkonyugasi tergantung apa enzim yang ter-
induksi, sehingga aktifitasnya akan berkurang atau menjadi
tidak aktif.
Tabel 5. Hasil pengamatan lama hidup mencit terinfeksi P. Berghei
(ANKA) dengan pemberian senyawa tinokrisposid dosis tunggal.
Hari Kematian Hewan
Dosis
(mg/kg BB)
No.
Hewan 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
*
*
K
1
2
3
*
*
*
15
1
2
3
*
*
*
22
1
2
3
*
*
*
30
1
2
3
*
*
*
44
1
2
3
*
*
*
62
1
2
3
*
*
*
90
1
2
3
*
KESIMPULAN
Senyawa tinokrisposid dapat menekan perkembangan P.
berghei dalam darah mencit dan memperpanjang hidup mencit
yang terinfeksi. Efek optimal diberikan pada dosis 44 mg/kg
bb.
SARAN
Perlu dilakukan uji efek tinokrisposid terhadap Plas-
modium malaria pada manusia secara in vitro dan dilanjutkan
dengan uji klinis.
Keterangan :
* = Hewan mati
KEPUSTAKAAN
K = Kontrol terinfeksi P. berghei (ANKA) tanpa diobati
1. Adnan AZ. Pemeriksaan dan Isolasi Kandungan Kimia Tumbuhan
Brotowali. Dalam : Tetumbuhan Sebagai Sumber Bahan Obat, Rusdi
(Penyunting), Pusat Penelitian Universitas Andalas, Padang 1988.
Pada metode dosis tunggal, persentase parasitemia yang
diamati adalah sehari setelah pemberian senyawa uji dan in-
okulasi parasit. Uji statistik terhadap data yang diperoleh me-
nunjukkan bahwa senyawa tinokrisposid memberikan efek
yang berbeda sangat nyata bila dibandingkan dengan kontrol.
2.
Depkes RI. Materia Medika, jilid II. Jakarta 1988.
3. Depkes RI Penelitian Tanaman Obat di Beberapa Perguruan Tinggi di
Indonesia I-II, Jakarta 1988.
4. Adnan AZ, Pachaly P. Tinocrisposid, ein neues Furanoditerpenglycosid
aus Tinospora crispa Miers. Arch Pharm (Weinheim), 1992; 325.
Pada metode dosis ganda, persentase parasitemia diamati
24 jam setelah inokulasi parasit sebelum pemberian senyawa
tinokrisposid pertama, kemudian 24 jam setelah pemberian
senyawa tinokrisposid kedua, dan 24 jam setelah pemberian
senyawa tinokrisposid ketiga. Pemeriksaan darah dilakukan
setiap hari selama empat hari berturut-turut untuk mengetahui
potensi pengaruh tinokrisposid terhadap Plasmodium; ternyata
senyawa tinokrisposid dapat menekan pertumbuhan P. berghei
dalam darah mencit.
5.
Adnan AZ, Mukhtar HM, Almahdy. Pemeriksaan Farmakologi Senyawa
Furanoditerpenglikosida Baru dari Tinospora crispa Miers (Brotowali).
Makalah pada Seminar Nasional Tumbuhan Obat Indonesia VIII, Jakarta,
16-17 Oktober 1995.
6. Rochanakij S, Thebtaranonth Y, Yenjai C, Yuthafong Y. Nimbolid A
constituent of Azadirachta indica inhibits Plasmodium falcifarum in
culture. Ann Trop Med and Parasitol 1985; 16 (1).
7.
Malaria Unit Division of Control of tropical Diseases WHO. Ministerial
Conference on Malaria, Amsterdam: 26-27 Oktober 1992.
8.
Bruce-Chatt LJ. Essential Malariologi, London : 1988.
Dari grafik hubungan antara dosis dengan persentase
parasitemia rata-rata pada cara dosis tunggal (Gambar 7) dan
cara dosis ganda (Gambar 8). terlihat bahwa efek menghambat
perkembangan P. berghei pada mencit tergantung pada besar-
nya dosis, sampai dosis 44 mg/kg bb; pada dosis lebih dari 44
mg/kg bb tidak lagi terlihat kenaikan efek bahkan cenderung
menurun.
9. Brown HW. Dasar-dasar parasitologi Klinik. Edisi III. Diterjemahkan
oleh Bintari Rukmono, Gramedia, Jakarta, 1982.
10. Peter SW, Richard WHG. Anti malaria Drug. 17-ed. Springer Verlag,
Berlin Heidelberg, New York, Tokyo: 1984.
11. Hawking F, Gammage K, Worms MJ. The Asexual dan Sexual Circadian
Rhythms of Plasmodium vinkel, P. chabaodi, P. berghei and P.
gallinaceum. Parasitol, 1972; 65.
12. Depkes RI. farmakope Indonesia, edisi III, Jakarta, 1979.
13. Schefler CW. Statistik Untuk Biologi, Farmasi, Kedokteran dan Ilmu
Bertautan. Terj Suroso, edisi II, Penerbit ITB, Bandung 1987.
Fenomena seperti ini sering terjadi pada pengujian bebe-
rapa obat karena beberapa kemungkinan; pertama misalnya
seperti, senyawa kofein pada dosis tertentu berefek stimulan
sedangkan pada dosis yang lebih tinggi menjadi berlawanan
14. Thomson EB. Drug Bioscreening, Fundamental of Drug Evaluation
Tehnnique in Pharmacology. New York : Grace Way Publi Co, 1985.
15. Reynolds JEF. Martindale The Extra Pharmacopeia. 30
th
ed. London : the
Pharmaceutical Press, 1872.
Cermin Dunia Kedokteran No. 131, 2001
31