H A S I L P E N E L I T I A N
CDK 167/vol.36 no.1/Januari - Februari 2009
PENDAHULUAN
Perkembangan teknologi yang pesat dewasa ini, telah mengaki-
batkan pencemaran lingkungan yang makin berat. Sejalan dengan
itu maka perlu dilakukan suatu penelitian tentang respon biologik
dari xenobiotik atau senyawa yang bersifat racun, untuk dapat
memahami efeknya terhadap tubuh manusia.
Salah satu xenobiotik yang cukup akrab dengan kehidupan manusia
sehari-hari adalah benzo(
)piren (BP). BP merupakan senyawa
hidrokarbon polisiklik aromatik yang digolongkan sebagai senyawa
pro karsinogen kuat. Senyawa ini dijumpai di lingkungan sebagai
hasil pirolisis lemak atau sebagai hasil proses pembakaran yang
tidak sempurna, seperti pada daging panggang, sate, makanan
yang diasap, asap rokok dan asap kendaraan bermotor
(1, 2, 3)
.
Hingga saat ini masih terus berkembang anggapan BP sebagai
penyebab kanker. Sebagai senyawa karsinogen, BP dapat me-
nimbulkan mutasi gen yang dapat dimanifestasikan sebagai
kerusakan kromosom, yaitu terjadi aberasi atau terbentuk patahan-
patahan kromosom.
Pada tahap telofase, fragmen kromosom dan atau massa kromatin
dalam sel akan tertinggal pada sitoplasma membentuk struktur
menyerupai inti sel dengan diameter antara 1/20 sampai 1/5
diameter inti yang dinamai mikronukleus(MN)
(4)
. Jadi terbentuknya
mikronukleus pada sel merupakan indikasi terjadinya aktivitas
mutagenik yang merusak kromosom.dan akhirnya memicu terjadi-
nya kanker. Metode penentuan MN yang cukup sederhana dapat
dilakukan pada sel PCE dari apusan sumsum tulang hewan rodensia
(5)
.
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek mutagenik BP,
melalui uji MN pada sel PCE yang diambil dari sumsum tulang femur
mencit albino.
BAHAN DAN TATA KERJA
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini berkualitas
proanalisis diperoleh dari E. Merck terdiri atas: BP, metanol, etanol,
larutan garam fisiologis, larutan pewarna Giemsa yang telah di-
encerkan lima kali dalam metanol dan Oleum olivarum. Peralatan
yang digunakan adalah kaca objek, standing jar, berbagai alat gelas,
alat suntik, kandang tikus dan mikroskop Nikon MM-21 dengan
pembesaran 2000 kali.
33
Uji Mutagenisitas Benzo(
)piren dengan
Metode Mikronukleus pada Sumsum
Tulang Mencit Albino (Mus musculus)
Yana Sumpena*, Rochestri Sofyan*, Rusi Rusilawati**
*Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknik Nuklir - BATAN, **Universitas Pendidikan Indonesia
ABSTRAK
Benzo (
) piren (BP) sebagai senyawa yang bersifat karsinogen diduga dapat menimbulkan kerusakan
pada kromosom. Salah satu cara pemeriksaan kerusakan kromosom adalah dengan uji mikronukleus
(MN). Efek mutagenik dari BP telah diteliti menggunakan uji MN pada sel eritrosit polikromatik (PCE) dari
sumsum tulang femur mencit albino. Mencit albino diberi perlakuan dengan menginjeksikan larutan BP
0,3% (b/v) sebanyak 0,1 ml pada daerah tengkuk secara subkutan, sebanyak sepuluh kali dalam interval
waktu satu hari. Setelah 120 hari, baik mencit perlakuan maupun kontrol dibunuh dengan cara dislokasi
leher, diambil sumsum tulang femurnya, lalu dibuat preparat apusan dengan pewarnaan Giemsa. Terben-
tuknya MN pada sel PCE diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 2000 kali. Banyaknya MN
dalam sel PCE atau MNPCE dihitung per 1000 sel PCE, yang kemudian disebut sebagai frekuensi MNPCE,
dengan satuan permil. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa pemberian BP dapat menyebabkan fre-
kuensi MNPCE menjadi 38,82 Ø 8,70 permil (n=10) dibandingkan dengan kontrol dengan frekuensi
MNPCE sebesar 2,19 Ø 0,99 permil (n=10). Kenaikan frekuensi MNPCE yang cukup besar tersebut menun-
jukkan bahwa BP memiliki efek mutagenik dengan tingkat mutagenisitas yang cukup tinggi.
Kata kunci: benzo (
) piren, mikronukleus, karsinogen.
H A S I L P E N E L I T I A N
CDK 167/vol.36 no.1/Januari - Februari 2009
32
DAFTAR PUSTAKA
1. Departemen Kesehatan RI. Rencana Strategis Nasional Penanggulangan
Gangguan Penglihatan dan Kebutaan (PGPK) untuk Mencapai Vision 2020.
Jakarta,
2003.
2. Chopdar A, Chakravarthy U. Age-related macular degeneration. BMJ 2003;
326:485-8.
3. O
,
Connel SR, Bressler NM. Age-related macular degeneration. Dalam:
Regillo CD, Brown GC, Flynn HW, penyunting. Vitreoretinal disease: the
essentials. New York: Thieme Medical Publisher; 1999:213-40.
4. Sarks SM, Sarks JP. Age-related maculopathy: non neovascular age-related
macular degeneration and the evolution of geographic atrophy. Dalam: Ryan
SJ, penyunting. Medical Retina. Edisi ke-3. Vol. 2. Singapore: Mosby. 2001:
1064-96.
5. Bressler NM. Early detection and treatment of neovascular age-related
macular degeneration. JABFP 2002; 15:142-52.
6. Evans J. Age-related macular degeneration. Dalam: Johnson GJ, Minassian
DC, Weale RA, West SK, penyunting. The epidemiology of eye disease. Edisi
ke-2.
London:Arnold
2003:356-68.
7. American Academy of Ophthalmology. Age-related macular degeneration,
preferred practice pattern. San Francisco: American Academy of Ophthal-
mology, 2003 (dikutip 10 Desember 2004). URL: http:// www.aao.org/
aao/education
library/ppp/index.cfm.
8. Seddon JM. Epidemiology of age-related macular degeneration. Dalam: Ryan
SJ, penyunting. Medical Retina. Edisi ke-3. Vol. 2. Singapore: Mosby; 2001:
1039-47.
9. Bressler NM, Bressler SB, Fine SL. Neovascular (exudative) age-related macular
degeneration. Dalam: Ryan SJ, penyunting. Medical Retina. Edisi ke-3. Vol. 2.
Singapore:
Mosby;2001:1100-31.
10. Cavallerano AA. Age-related macular degeneration. Dalam: Cavallerano AA,
Gutner RK, Oshinskie LJ, penyunting. Macular disorder and illustrated diag-
nostic guide.Boston: Butterworth-Heinemann;1997:111-34.
11. Deutman A. Age-related macular degeneration. Dalam: Boyd BF, Boyd S.
penyunting. Retinal and vitreoretinal surgery. Panama: Highlights of Ophthal-
mology 2002:237-95.
12. Schatz H, Yannuzzi LA, Gitter KA. Subretinal neovascularization. Dalam:
Yannuzzi LA, Gitter KA, Schatz H, penyunting. The macular a comprehensive
text and atlas. USA: Baltimore; 1979:180-208.
13. Kraut JA. Vision rehabilitation. Dalam: Tasman W, Jaeger EA, penyunting.
Duane_s Clinical Ophthalmology (CD-ROM). Baltimore:Lippincott Williams &
Wilkins;2003.
14. Amin HI, Donald HR, Johnson RN, Ai E, Schatz H. Age-related macular
degeneration. Dalam: Tasman W, Jaeger EA, penyunting. Duane_s Clinical
Ophthalmology (CD-ROM). Baltimore:Lippincott Willians & Wilkins;2003.
15. Lanzetta P, Michieletto P, Pirracchio A, Bandello F.Early vascular changes
induced by transpupillary thermotherapy of choroidal neovascularization.
Ophthalmology
2002;109:
1098-1104.
16. Reichel E, Berrocal AM, Kroll AJ, Desai V, Duker JS, Puliafito CA. Transpupillary
thermotherapy of occult subfoveal chroidal neovascularization in patients with
age-related macular degeneration. Ophthalmology 1999;106: 1908-14.
Tajam penglihatan rendah (low vision) perlu perhatian karena dalam
hitungan minggu dapat menjadi buta, terutama bila dijumpai
drusen lima atau lebih, terdapat satu atau lebih drusen yang ber-
ukuran besar, adanya hiperpigmentasi fokal dan adanya riwayat
hipertensi sistemik;
9
untuk mengantisipasinya, setiap penderita
dengan drusen di makulanya agar memantau sendiri penglihatan
sentralnya dengan menggunakan kartu Amsler; jika terlihat
distorsi garis lurus (metamorfopsia) dan bercak hitam (skotoma
sentral), penderita harus segera mendapatkan tindakan.
9
Setiap
ophtalmolog disarankan selalu melakukan pemeriksaan fundus
karena kebanyakan ARMD tanpa keluhan tajam penglihatan
selama belum melibatkan penglihatan sentral.
Scar disiformis adalah bentuk akhir dari neovaskular. Karena proses
iskemik terbentuk pembuluh darah baru berupa neovaskularisasi
choroidal (CNV) di submakula. CNV mudah pecah menyebabkan
perdarahan subretina; jaringan scar ini dapat terus berproliferasi
sehingga dapat menimbulkan ablasio (lepas) retina.
9-12
Penderita
dapat memanfaatkan sisa penglihatannya dengan menggunakan
alat bantu optik seperti lensa, teleskop, kaca pembesar atau
CCTV (close circuit television).
13
Saat ini banyak pilihan tindakan, tetapi bukan untuk memper-
baiki penglihatan melainkan hanya untuk mempertahankan
penglihatan yang masih tersisa. Oleh karena itu hanya sebagian
kecil responden yang bersedia menjalani intervensi, karena selain
faktor di atas juga biaya yang tidak kecil. Pemeriksaan fundus
fluorescein angiography (FFA) merupakan gold standard pada
kecurigaan CNV. Gambaran FFA dapat menentukan tipe lesi,
ukuran dan lokasi CNV, sehingga tindakan selanjutnya dapat
dipertimbangkan. FFA juga digunakan sebagai penuntun tindakan
laser dan sebagai pemantau dalam menentukan adanya CNV
yang menetap atau berulang setelah tindakan laser.
7,9,14
Pada penelitian ini hanya sebagian (14 penderita) yang bersedia
menjalani FFA dan dari hasil FFA hanya 2 penderita yang
menjalani tindakan Transpupillary thermotherapy (TTT). TTT
merupakan suatu terapi yang sedang berkembang; menggu-
nakan iradiasi rendah dengan sinar laser inframerah (810 nm)
sehingga panas yang dihasilkan tidak merusak jaringan dan
dapat digunakan pada CNV subfovea dengan lesi okult.
15,16
Saran
Penelitian ini merupakan langkah awal terhadap ARMD yang mem-
punyai akses ke Pusat Pelayanan Mata (Rumah Sakit Mata), sehingga
angka ARMD yang diperoleh belum mencerminkan keadaan yang
sesungguhnya di dalam masyarakat.
Untuk itu :
1. Perlu dilakukan kajian epidemiologis.
2. Untuk efisiensi perlu disosialisasikan penggunaan kartu Amsler.
3. Perlu fasilitas direct opthalmoskop di puskesmas
H A S I L P E N E L I T I A N
CDK 167/vol.36 no.1/Januari - Februari 2009
35
Hewan percobaan adalah mencit albino (Mus musculus) galur
Swiss Webster yang dikembangkan di P3TkN. Mencit albino yang
dipilih adalah yang berjenis kelamin betina dengan bobot badan
antara 20 40 gram, berumur 2 3 bulan sebanyak 20 ekor
(10 ekor perlakuan dan 10 ekor kontrol). Mencit dipelihara dalam
ruangan dengan suhu berkisar antara 22 25
o
C dan kelemba-
pan 70 80%. Pakan tikus terdiri atas pelet dan air minum yang
diberikan secara ad libitum. Mencit disuntik dengan larutan BP
dalam oleum olivarum secara subkutan di daerah interskapuler
(tengkuk) dengan dosis 0,3 mg /0,1 ml sebanyak sepuluh kali
dalam interval satu hari. Pengamatan dilakukan dua kali sehari
selama 120 hari, saat benjolan kanker pada mencit telah tumbuh
optimal. Pembuatan dan pewarnaan preparat dilakukan menurut
metode Schmid
(6)
. Hewan perlakuan yang telah diamati selama
120 hari dan juga hewan kontrol dibunuh dengan cara dislokasi
leher, lalu dibedah; tulang femurnya diambil dan dibersihkan dari
perlekatan otot dengan pisau bedah dan tissue. Ujung proksimal
tulang ini digunting dan sumsumnya diaspirasi dengan semprit
berisi 1 ml larutan garam fisiologis (NaCl 0,9%). Suspensi
sumsum tulang disentrifuga selama 10 menit dengan kecepatan
1000 rpm, lalu endapannya diambil dan dibuat preparat apusan
pada kaca objek. Setelah dikeringkan satu malam untuk fiksasi,
preparat diwarnai dengan pewarna Giemsa dalam metanol.
Pertama-tama preparat kering dimasukkan ke dalam larutan
metanol absolut yang dituang ke dalam standing jar selama 30
menit, setelah itu preparat dipindahkan ke dalam standing jar
lain yang berisi pewarna Giemsa-metanol dan dibiarkan lagi
selama 30 menit. Preparat yang sudah diwarnai ini selanjutnya
dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan kering. Untuk memper-
tajam perbedaan antara sel PCE dengan sel yang lain, preparat
dicuci ulang dengan cara merendam secara berturut-turut dalam
etanol 30%, 50%, 70%, 80% dan etanol absolut. Lama setiap
perendaman 10 menit dan setiap selesai perendaman preparat
dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Terakhir direndam
kembali dalam xylol selama 10 menit, dibilas dengan air mengalir
dan dikeringkan.
Pengamatan MN pada preparat dilakukan dengan mikroskop
dengan pembesaran 2000 kali. Pada sumsum tulang terdapat
berbagai variasi tipe sel yang dapat digunakan untuk penghitu-
ngan MN. Untuk mengurangi jumlah variabel pengganggu yang
dapat mempengaruhi pengamatan, maka pemeriksaan MN
hanya dilakukan pada satu tipe sel yaitu hanya pada sel PCE.
Keuntungannya adalah sel PCE pada preparat mudah dikenali
dari warnanya yang relatif kontras dibandingkan sel lain. Sel PCE
merupakan sel eritrosit muda yang baru mengalami mitosis dan
sintesis DNA, mengandung banyak ribosom serta memiliki inti.
Selain warnanya relatif kontras, ukurannya relatif besar dan
penyebarannya terbatas dibandingkan dengan sel lain maupun
sel eritrosit dewasa atau sel eritrosit normokromatik (NCE).
Pemeriksaan dilakukan dengan cara mengamati struktur MN
pada sel PCE selanjutnja disebut MNPCE dan menghitungnya
untuk tiap 1000 sel PCE. Jumlah MNPCE dalam 1000 sel PCE
kemudian disebut sebagai frekuensi MNPCE yang dinyatakan
dalam permil.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Secara teoritis MN adalah kromatin sitoplasmik yang tampak
sebagai inti kecil terbentuk dari fragmen atau patahan kromo-
som yang diasingkan dari inti (nukleus), pada tahap anafase
pembelahan sel. Setelah mencapai tahap telofase, elemen sentris
menjadi inti sel anak, sedang fragmen kromosom yang tertinggal
tetap berada pada sitoplasma membentuk inti kecil yang disebut
MN. Zat asing bersifat karsinogen seperti BP, berpengaruh pada
proses pembelahan sel. Kanker berawal dari kelainan gen yaitu
pada kromosom. Terjadinya kerusakan kromosom yang menga-
rah ke kanker, dapat termanifestasikan sebagai terbentuknya
MN. Jadi terbentuknya MN setelah pemberian BP menandakan
bahwa BP karsinogenik. Pada penelitian ini sumsum diambil dari
tulang femur atas pertimbangan bentuk tulang femur lurus dan
ukurannya relatif besar, sehingga pengambilan sumsum lebih
mudah. Struktur MN yang teramati di bawah mikroskop dengan
pembesaran 2000 kali tampak sebagai bintik hitam berbentuk
bulat atau hampir lonjong, terletak eksentrik atau agak perifer
pada sel PCE, dengan diameter antara 1/20 1/5 kali diameter
inti (Gb. 1).
Gambar 1.Penampakan MN pada sel PCE mencit albino yang diinduksi
kanker dengan BP
Hasil penelitian diperoleh dari sepuluh tikus (perlakuan) dan sepuluh
tikus (kontrol); menunjukkan bahwa pemberian BP dapat mening-
katkan frekuensi MNPCE sampai 38,82 Ø 8,70 permil (n=10)
dibandingkan dengan kontrol 2,19 Ø 0,99 permil (n=10). Dari
data ini terbukti bahwa BP karsinogenik yang juga ditunjukkan
oleh hasil pengamatan morfologik terjadinya benjolan di tengkuk
tikus. Nilai frekuensi MNPCE yang cukup tinggi setelah pembe-
rian BP menunjukkan bahwa mutagenisitas BP cukup tinggi.
Sayangnya hingga saat ini belum ada ketentuan nilai batas
ambang frekuensi MNPCE. Akan tetapi mengingat terjadinya
kanker melewati proses yang panjang dan dapat berawal dari
setitik kelainan
(7)
, maka kenaikan frekuensi MNPCE sekecil
apapun perlu disikapi. Sebagai pembanding, herbisida paraquat
juga dapat menginduksi frekuensi MNPCE pada konsentrasi
57,38 dan 66,56 mg/kg bobot badan masing-masing menjadi
8,4 Ø 1,6 permil dan 10,6 Ø 1,9 permil dengan frekuensi MNPCE
kontrol sebesar 2,4 Ø 1,4 permil.
(8)
.
IKLAN 8
Cernevit
H A S I L P E N E L I T I A N
CDK 167/vol.36 no.1/Januari - Februari 2009
Nilai ini tidak sebesar nilai yang diperoleh pada pemberian BP,
padahal paraquat termasuk herbisida kelas dua ditinjau dari
dampak kesehatan terhadap manusia (WHO). Bahkan di Malaysia
pemakaiannya sangat dibatasi dan mendapat pengawasan yang
cukup ketat. Akan tetapi perlu diingat pula bahwa pada penelitian uji
mutagenitas paraquat digunakan tikus Wistar (Rattus norvegicus),
sedang pada penelitian ini digunakan mencit albino yang ukuran
dan bobot tubuhnya lebih kecil yaitu sekitar 1/5 bobot tikus Wistar.
Dari pengalaman penentuan MN, penggunaan mencit sebagai
hewan percobaan penanganannya lebih mudah dan praktis di-
bandingkan dengan penggunaan tikus. Penelitian ini dapat dilanjut-
kan ke arah penggunaan parameter MN antara lain untuk uji
kemanjuran obat antikanker misalnya dari zat bioaktif tanaman
obat, dengan cara mengamati perubahan frekuensi MNPCE pada
sumsum tulang tikus yang telah diinduksi kanker dengan BP.
SIMPULAN
Pemeriksaan MN pada sel PCE dari tulang femur mencit albino
dapat digunakan untuk mengamati adanya paparan xenobiotik.
Dilihat dari frekuensi MNPCE-nya, BP memiliki efek mutagenik
dengan tingkat mutagenitas cukup tinggi.
DAFTAR PUSTAKA
1. Atlas RM, Cerniglia CE. Bioremediation of petrolium pollutants: Diversity
and environmental aspects of hydrocarbon biodegradation. Bioscience
1995; 45 (5): 25-40
2. Tandjojo N. Pengaruh Benzo (
) piren terhadap Beberapa Sifat Biokimia
Khamir. Disertasi FMIPA-ITB 1992.
3. Noor Cholies, Komponen Herba Veronica cinneria yang Berkhasiat
Anti Kanker. Disertasi, FMIPA-ITB 1982.
4. Fenech M, Marley AA. Measurement of micronuclei in lymphocytes.
Mut.Res. 1985; 147 : 29-40.
5. Auletta A. Current status of short term test for carcinogenicity. J. Env.
Sci. Health 1991; 8 (1): 31-43.
6. Schmid W. The micronucleus test. Mut. Res. 1975; 31: 9 -15.
7. Weinberg RA. How cancer arises. Scient Am. September 1996 : 32-40.
8. Hadiansyah C, Yunarni E, Hartati T. Uji mutagenisitas herbisida paraquat
dengan metoda mikronukleus pada sumsum tulang tikus Wistar. Pros.
Kongres HITOKSI Jakarta 22 - 23 Februari 1999. Himpunan Toksikologi
Indonesia, 2000: 67-77.
36