Cermin Dunia Kedokteran

TEKNIK

Pengembangan Uji Diagnostik melalui

Teknik Molekuler

Rochman Na'im

Jurusan Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan

Institut Pertanian Bogor, Bogor

PENDAHULUAN

Dalam bidang kedokteran (manusia maupun hewan), uji-uji

diagnostik merupakan salah satu metode untuk menangani kasus

penyakit. Berbagai uji diagnostiktelahdikembangkan, baik yang

didasarkan pada teknik kultur agen penyakit, reraksi kimia/

biokimia maupun reaksi imunologik. Dengan berkembangnya

teknologi dalam bidang biologi molekuler, maka pengembangan

uji-uji diagnostik mulai diarahkan kepada teknologi tersebut

yang menggunakan materi genetik sebagai dasar pengujiannya.

Materi genetik yang berupa asam nukleat baik DNA (Deoxy-

ribose Nucleic Acid) maupun RNA (Ribo Nucleic Acid) mengan-

dung tiga komponen, yaitu: 1) basa (purin dan pirimidin); 2) gula

(deoksiribosa untuk DNA dan ribosa untuk RNA); dan 3) fosfat.

Basa purin yang terdapat pada DNA maupun RNA adalah sama,

yaitu Adenine [A] dan Guanine [G] sedangkan basa pirimidin

berbeda, untuk DNA adalah Cytocine [C] dan Thymine [T] dan

untuk RNA kedudukan Thymine digantikan oleh Uracil [U]

Kedua unsur basa tersebut (purin dan pirimidin) akan berpa-

sangan membentuk kode-kode genetik pada DNA maupun RNA

melalui ikatan hidrogen (A akan berpasangan dengan T [pada

DNA] atau A dengan U [pada RNA]; dan G dengan C). Unsur

gula dan fosfat akan membentuk struktur DNA dan RNA. DNA

memiliki struktur rantai ganda sedangkan RNA memiliki rantai

tunggal. Struktur DNA lebih stabil bila dibandingkan dengan

RNA.

Berdasarkan materi genetik tersebut, uji-uji diagnostik di-

kembangkan melalui teknik-teknik molekuler seperti hibridisasi

dengan probe asam nukleat; polymerase chain reaction (PCR),

restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan sekuensing

asam nukleat.

HIBRIDISASI

Mekanisme dasar di balik uji-uji diagnostik yang meng-

gunakan probe asam nukleat adalah hibridisasi. Teknik ini di-

dasarkan pada perpaduan dua basa nukleotida dan rantai asam

nukleat yang komplementer (DNA dengan DNA atau RNA; dan

RNA dengan RNA).

Teknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu proses denatu-

rasi atau pemisahan dua rantai asam nukleat yang komplementer

dari proses renaturasi atau perpaduan kembali dua rantai asam

nukleat. Proses denaturasi biasanya dilakukan dengan cara pe-

manasan DNA untuk memecah ikatan hidrogen yang terdapat

di antara pasangan basa sehingga rantai asam nukleat akan

terpisah. Proses ini kemudian diikuti dengan proses renaturasi

dengan cara pendinginan.

Uji-uji yang menggunakan hibridisasi membutuhkan proses

denaturasi dan fragmen asam nukleat yang tidak diketahui dan

memfiksasi fragmen tersebut pada bahan solid seperti filter

nitroselulosa. Kemudian suatu probe asam nukleat yang kom-

plementer dicampurkan dengan fragmen asam nukleat yang

terdapatpada bahan solid tersebut pada kondisi yang mendukung

terjadinya hibridisasi. Proses hibridisasi dapat juga dilakukan

dalam larutan (bukan bahan solid). Baik DNA yang hendak

didiagnosis (target) maupun probe dimasukkan dalam larutan

buffer. Kedua DNA tersebut bebas bergerak dan proses hibridi-

sasinya berlangsung 510 kali lebih cepat danipada di bahan

solid. Keadaan tersebut sangat penting dalam aplikasi kebanyak-

an diagnostik mikrobiologi yang memiliki konsentrasi DNA

target sangat sedikit dan membutuhkan waktu diagnosis lebih

cepat.

Kondisi yang dapat mempengaruhi apakah dua rantai

asam nukleat akan berhibridisasi disebut stringency. Kondisi

stringency yang kuat akan mendukung perpaduan dua basa dari

dua rantai yang komplementer dengan tepat. Sedangkan kondisi

stringency yang lemah akan menyebabkan banyaknya perpadu-

an dua basa yang tidak sesuai di antara dua rantai asam nukleat.

Cermin Dunia Kedokteran No. 110, 1996

Salah satu kondisi yang mempengaruhi hibridisasi adalah

tipe asam nukleat yang akan dihibndisasi. Perpaduan dua basa

antara dua rantai DNA tidak sekuat pasangan basa antara DNA

dan RNA. Rantai asam nukleat yang lebih panjang dengan

jumlah pasàngan basa yang komplementer lebih banyak akan

berhibridisasi lebih kuat daripada rantai yang pendek. Kompo-

sisi basa asam nukleat juga akan mempengaruhi hibridisasi,

karena pasangan basa G-C lebih kuat daripada pasangan A-T.

Selain itu temperatur dan kekuatan ionik buffer yang digunakan

juga akan mempengaruhi reaksi hibridisasi.

Probe asam nukleat adalah suatu fragmen rantai tunggal

dari DNA atau RNA yang komplementer yang telah dilabel.

Probe ini dapat dibuat sesuai dengan komposisi basa yang ter-

dapat pada gen dan suatu agen penyakit sehingga probe tersebut

hanya dapat berhibridisasi dengan gen dan agen penyakit ter-

sebut dan secara spesifik akan mendeteksi adanya agen penyakit.

Ada berbagai cara untuk memperoleh dari melabel probe

asam nukleat. Sebuah gen dan agen penyakit yang akan dideteksi

hams dimurnikan terlebih dahulu, kemudian dilabel apakah

dengan radioisotop seperti

P atau dengan substansi non-radio-

isotop. Walaupun substansi non-radioisotop dan dapat disimpan

dalam waktu yang lebih lama. Sensitifitas uji diagnostik meng-

gunakan probe yang dilabel dengan non-radioisotop dapat di

,tingkatkan dengan penggunaan PCR. Substansi non-radioisotop

yang paling sering digunakan sebagai label adalah biotin dan

digoxigenin.

Probe yang dilabel dengan biotin akan dideteksi dengan

menggunakan konjugat streptavidin-alkaline phosphatase (atau

enzim lain) dan pewarna yang sesuai untuk menghasilkan reaksi

yang berwarna seperti pada reaksi ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay). Untuk probe yang dilabel dengan

digoxigenin, konjugat antibodi terhadap digoxigenin dengan

berbagai enzim dapat digunakan dengan substrat yang sesuai

untuk menghasilkan reaksi berwarna. Bila antibodi terhadap

digoxigenin dikonjugasikan dengan alkaline phosphatase, substrat

chemiluminescent dapat digunakan untuk menghasilkan reaksi

bercahaya, yang bila diekspos ke film sinar X akan memberikan

metode deteksi yang sensitif.

Probe dapat juga dibuat dari oligonukleotida (biasanya

terdiri dari 30-40 nukleotida) yang dibuat secara sintetik.

Oligonukleotida tersebut dapat berupa fragmen DNA rantai

tunggal atau fragmen RNA yang dilabel.

Probe asam nukleat dapat digunakan pada hampir seluruh

agen patogen, baik untuk digunakan dalam laboratonium riset

sebagai alat eksperimental atau untuk uji-uji diagnostik yang

sifatnya komersial.

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Salah satu perkembangan teknik biologi molekuler yang

sangat membantu dalam pengembangan uji-uji diagnostik ada-

lah PCR. PCR dapat mengamplifikasi DNA dan jumlah yang

sedikit menjadi jumlah yang dapat dideteksi/banyak.

Adanya penemuan DNA polymerase (Taq polymerase) yang

stabil pada temperatur tinggi dan pengembangan alat yang

mengatur temperatur proses PCR secara otornatis, telah mem-

buat PCR dapat digunakan untuk uji-uji diagnostik secara

praktis.

DNA polymerase adalah enzim yang dapat mensintesis

rantai DNA yang baru dan DNA yang sudah ada. Penemuan

enzim yang tahan panas sangat membantu untuk mensintesis

DNA barn, karena tahap awal proses PCR dilakukan dengan

cara pemanasan rantai DNA yang sudah ada pada temperatur

90°C.

Untuk mengamplifikasi DNA dilakukan 30-40 kali siklus

proses PCR. Satu siklus terdiri dari 3 tahap, yaitu tahap denatu-

rasi pada temperatur 95°C, tahap hibridisasi primer pada tem-

peratur 37° sampai 56°C dan tahap polimerisasi pada temperatur

72°C.

Secara umum, DNA yang akan diamplifikasi diapit oleh se-

pasang primer sintetik yang merupakan potongan pendek dari

DNA yang spesifik/komplementer yang berfungsi sebagai

template dari DNA yang akan diamplifikasi. DNA target yang

akan diamplifikasi didenaturasi terlebih dahulu dengan pema-

nasan, kemudian primer ditambahkan pada DNA target dan

temperatur diturunkan agan terjadi proses hibridisasi. Bila tahap

polimerisasi dimulai, maka rantai DNA target yang terdapat di

antara primer akan diperbanyak menjadi dua rantai dengan pan-

jang yang sama seperti DNA target. Dengan adanya pengulang-

an tahap-tahap denaturasi, hibridisasi dan polimerisasi beberapa

kali, maka DNA target akan diperbanyak secana efektif.

Bila enzim reverse transcriptase yang mensintesis DNA

dan template RNA, digunakan pada tahap awal proses PCR,

maka RNA ribosom dan genomik dan virus RNAjuga dapat di-

amplifikasi.

PCR dapat digunakan dalam uji-uji diagnostik untuk

mengamplifikasi asam nukleat dan agen-agen penyakit yang

ada dalam jumlah sedikit sehingga sensitifitas uji dapat diting-

katkan. DNA yang telah diamplifikasi selanjutnya diidentifikasi

dengan teknikhibridisasi yang rnenggunakan probe asam nukleat

yang spesifik, atau dengan analisis restriction fragment length

polymorphism (RFLP) dan elektroforesis pada gel aganose atau

dengan cara sekuensing.

RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMOR-

PHISM (RFLP)

Teknik ini menggunakan enzim-enzim restriksi yang ber-

fungsi sebagai pemotong DNA rantai ganda pada sekuens yang

spesifik, untuk menentukan apakah dua fragmen DNA memiliki

kesamaan. Dalam teknik ini, DNA didigesti atau dipotong de-

ngan enzim restriksi tertentu, kemudian dielektroforesis pada gel

aganose yang akan memisahkan fragmen DNA yang dipotong

sesuai dengan ukurannya. Kalau DNA tidak identik ukurannya,

maka pola fragmen DNA pada gel tidak akan sepadan. Bila pola

fragmen DNA sarna, maka enzirn restriksi tersebut akan diguna-

kan untuk menentukan apakah dua rantai DNA merniliki ke-

samaan.

Satu rantai DNA yang tidak diketahui dapat diidentifikasi

apakah berasal dari agen penyakit tertentu atau tidak dengan cara

pembar pola RFLP dengan referensi standar.

Cermin Dunia Kedokteran No. 110, 1996 33

SEKUENSING ASAM NUKLEAT

Sekuensing asam nukleat merupakan suatu metode untuk

menentukan urutan-urutan basa nukleotida (A, C, G dan T)

dalam suatu gen dan asam nukleat. Saat m sekuensing asam

nukleat dapat dilakukan secara otomatis dengan suatu alat yang

disebut nucleic acid sequencer. Peralatan tersebut dapat meng-

identifikasi secara cepat suatu mikroorganisme berdasarkan

sekuens dan genomiknya. Bila alat tersebut aplikasinya di-

kombinasikan dengan PCR, maka dapat dijadikan suatu alat uji

diagnostik yang sensitif dan spesifik.

Bagaimanapun uji-uji diagnostik yang didasarkan pada

teknik molekuler bukanlah sesuatu yang mudah, melainkan

membutuhkan keterampilan khusus. Teknik molekuler tersebut

seharusnya digunakan untuk mengembangkan uji-uji diagnostik

yang Iebih sensitif dan lebih spesifik dengan biaya yang relatif

tidak mahal.

Untuk agen-agen penyakit tertentu metode diagnosis seperti

antibodi monokional, ELISA, mikroskop elektron, immuno-

fluoresensi ataupun uj i-ui i diagnostik konvensional lainnya

masih memberikan hasil yang cukup baik. Dengan demikian

teknik molekuler hanya akan berfungsi sebagai pelengkap uji-

uji diagnostik yang telah ada.

Teknik-teknik molekuler yang telah diuraikan tersebut se-

baiknya digunakan untuk memahami atau mempelajari agen

penyakit pada tingkat molekuler dan interaksinya dengan induk

semang.

KEPUSTAKAAN

1. Brock TD, Madigan MT. Biology of Microorganisms. 5th ed. Prentice Hall.

New Jersey. 1988.

2. Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ. PCR Protocols: A Guide to

Methods and Applications. Academic Press, Inc. San Diego. California.

1990.

3. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. Harpers Biochemistry.

23rd ed. Prentice Hall International Inc. USA. 1993.

4. Old RW, Primrose SB. Principles of Gene Manipulation: An Introduction to

Genetic Engineering. Blackwell Scientific Publications. London. 1989.

5. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory

Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 1989.

6. Swaminathan B, PrakashG. Nucleic Acid and Monoclonal Antibody Probes:

Application in Diagnostic Microbiology. Marcel Dekker, Inc. New York.

1989.

Half the ease of life oozes away through the leaks of unpunctuality

Cermin Dunia Kedokteran No. 110, 1996