Cermin Dunia Kedokteran

TINJAUAN KEPUSTAKAAN

Diagnostik Thalassemia

dengan Polymerase Chain Reaction

Sunarto

Laboratorium Ilmu Kesehatan AnakIUPF Kesehatan Anak Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Macla

Rumah Sakit Umum Pusat Dr. Sardjito, Yogyakarta

Keywords : thalassemia gene mutation and deletion polymerase chain reaction 

amplification refractory mutation system covalent reverse dot-blot

PENGANTAR

Thalassemia adalah sindrom klinik yang disebabkan oleh

defek gena yang menyandi sintesis globin dengan akibat sintesis

globin mengurang atau tak ada sama sekali. Kekurangan sintesis

globin pada penderita thalassemia telah dibuktikan secara in

vitro pada retikulosit darah tepi penderita

(1,2,3)

Manifestasi klinik thalassemia sangat beraneka ragam dan

keaneka ragaman tadi hanya dapat dijelaskan dengan studi

molekular. Berbagai cara telah dikembangkan untuk kepenting-

an penelitian maupun untuk kepentingan praktis di lapangan, di

antarahya adalah sequencing atau pengurutan DNA (desoxyribo-

nucleic acid sequencing)

(4-8)

, dengan probe oligonukleotid radio-

aktif atau nonradioaktif

(9-12)

, linkage analysis dan deteksi lang-

sung dengan allele specific oligonucleotide primer (primer

ARMS)

(13,14,15)

Pada teknik diagnosis di atas, kecuali yang terakhir, DNA

hams digandakan lebih dulu untuk memperoleh sejumlah DNA

yang cukup untuk dianalisis. Sebelum teknik polymerase chain

reaction (PCR) ditemukan, penggandaan DNA dilakukan de-

ngan kloning

(6,8,16,17)

. Penggandaan DNA dengan kloning, rumit

dan memerlukan waktu sampai 10 hari. PCR merupakan suatu

prosedur penggandaan DNA secara in vitro yang praktis dan

memerlukan waktu hanya kira-kira 3 jam. PCR baik sebagai cara

penggandaan maupun untuk diagnostik amat praktis dan mem-

punyai akurasi tinggi

(15,18)

. Pada prosedur PCR berbagai masalah

timbul, demikian pula pada pengembangannya sebagai uji

diagnostik di lapangan.

Dalam makalah ini akan dibahas prinsip dan masalah PCR

secara teknis, dasar kelainan genetik thalassemia, masalah dan

kepentingan diagnostik thalassemia dengan menggunakan PCR.

PEMBAHASAN

Dasar molekular thalassemia

Hemoglobin terdiri atas haem dan globin. Globin pada orang

normal terdiri atas sepasang rantai polipeptid- dan sepasang

rantai non- (, , atau ) . Sintesis globin disandi oleh gena

yang unik; gena yang menyandi sintesis polipetid bersama

terletak pada lengan pendek kromosom 16, menempati regio

16-25 kb (kilo base pair). Gena yang menyandi sintesis rantai ,

, atau terletak pada lengan pendek kromosom 11 menempati

regio 55-60 kb. Rantai- dan rantai- hanya disintesis pada awal

kehidupan janin. Analisis urutan nukleotid semua gena globin

telah sangat luas dilakukan dan struktur gena itu telah didoku-

mentasikan sepenuhnya

(19)

. Gena globin terdiri atas 3 exon, yaitu

bagian yang diekspresikan atau menyandi sintesis polipeptid

globin, dan di antara ketiga exon tadi terdapat intron atau inter-

vening sequence (IVS) yang tak diekspresikan. Di samping itu di

sebelah hulu ujung 5' dan hulu ujung 3' terdapat non-coding DNA

atau flanking DNA

(20)

(Gambar 1).

Thalassemia terjadi bila gena globin mengalami delesi

(terutama pada thalassemia-) atau mutasi noktah (point muta-

tion) (terutama thalassemia-). Delesi genaglobin dapat mengenai

hanya sebagian dari gena atau satu gena seutuhnya, bahkan dapat

mengenai beberapa gena bersama-sama

(21)

(Gambar 2).

Mutasi yang berakibat thalassemia dapat terjadi pada exon,

pada IVS, pada flanking DNA ujung 5' maupun 3'

(9,21,22)

. Kelain-

an-kelainan tensebut akan menyebabkan mRNA globin tidak

atau sedikit sekali terbentuk atau terbentuk mRNA abnormal

yang tidak berfungsi, tidak stabil dan akan dihancurkan; akibatnya

terjadi defisiensi sintesis globin

(23,24)

. Poladelesi maupun mutasi

Cermin Dunia Kedokteran No. 110, 1996

Gambar 1. Bagan gena globin

Gambar 2. Beberapa tipe delesi pada gena-

bervariasi untuk berbagai populasi/ras dan wilayah geografi dan

variasi ini menyebabkan manifestasi thalassemia yang beraneka

ragam pu1a

(20)

PRINSIP PCR

PCR diperlukan pada diagnosis molekular, termasuk tha-

lassemia. Cara ini diperkenalkan pertama kali oleh Saiki et al.,

dari kelompok Cetus, tahun 1984_1985

(25)

. Pada awalnya PCR

dikembangkan sebagai cara untuk menggandakan DNA secara

in vitro, sebagai alternatif dan cara in vivo yang rumit dan me-

merlukan waktu lama.

Prinsip PCR dapat dijelaskan sebagai berikut

(25)

: bila DNA

dicampur dengan oligonukleotid yang komplementer dan diberi

kondisi yang sesuai, maka oligonukleotid tadi akan berperan

sebagai titik awal (primer) sintesis copy DNA target dengan

DNA target sebagai cetakan (template). Dengan menggunakan

dua primer, satu di sebeiah hulu (5') dan satu di sebelah hilir (3'),

segmen DNA yang terietak di antara kedua primer tadi akan

tergandakan.

Dalam pelaksanaannya DNA bersama deoxynucleosid

triphosphate (dATP = deoxyadenosine triphosphate, dCTP =

deoxycytidine triphosphate, dGTP = deoxyguanosine

triphosphate, dan dTTP = deoxythymidine triphosphate), enzim

polimerase, garam, bufer dan sepasang primer dicampur dalam

tabung reaksi. Campuran itu diberi suhu yang berselang-seling,

mula-mula 95°C selama 15 detik, kemudian suhu diturunkan

menjadi 54°C selama 15 detik dan kemudian dinaikkan lagi men-

jadi 72°C selama 30 detik

(15)

. Pada suhu 95°C DNA untai ganda

akan terurai menjadi DNA untai tunggal (proses denaturasi);

pada suhu 54°C primer akan menempel pada segmen DNA yang

komplementer (annealing) dan selanjutnya pada suhu 72°C di

bawah pengaruh enzim polimerase primer akan mengalami pe-

manjangan (extension). Ketiga langkah ini merupakan satu siklus

dan akan menghasilkan untai DNA tunggal yang komplementer

dengan segmen DNA target (copy DNA target). Dalam satu

siklus, satu untai DNA tunggal akan tergandakan menjadi 2

untai. Dengan n siklus, dari satu untai DNA teoretis akan dihasil-

kan 2 untai. Dengan 25 siklus dan satu untai DNA tunggai akan

dihasilkan lebih dari 30 juta copy untai DNA tunggal, cukup

banyak untuk proses analisis selanjutnya.

Pada awal pengembangan PCR timbul masalah yang sangat

menghambat pelaksanaan, yaitu rusaknya enzim polimerase

(fragmen Kienow) akibat suhu yang tinggi, sehingga sejumlah

enzim baru harus selalu ditambahkan seteiah setiap satu siklus.

Hal ini amat merepotkan. Dengan ditemukannya enzim Taq

(berasal dari bakteri Thermoaquatus) yang tahan panas sampai

100°C, maka permasalahan tersebut teratasi. Enzim Taq yang

dicampurkan pada awal pengerjaan dapat bertahan sampai se-

lesai, sehingga otomatisasi pengerjaan dapat diterapkan. Dengan

enzim yang tahan panas segmen DNA berukuran sampai be-

berapa kilo base pair (kb) dapat digandakan

(26)

Prosedur PCR dapat dilakukan terhadap setiap sel berinti

(yang mengandung DNA) seperti sel mukosa pipi, leukosit, sel

dalam cairan amnion, viii korialis, bahkan dari bahan fosil yang

masih mengandung DNA. Hal ini sangat memudahkan dalam

memperoleh cuplikan. Metode ini sangat sensitif sehingga mem-

butuhkan hanya sejumlah kecil cuplikan saja; DNA sejumlah

1 ug telah cukup. Dari single copy genes dapat diperoleh se-

jumlah copy DNA cukup untuk dianalisis

(8)

. Setetes darah kering

pada kentas saring cukup untuk mendeteksi genotip penderita

tha1assemia

(10)

. DNA produk PCR dapat disimpan dan dapat di-

gunakan sebagai cuplikan untuk digandakan lagi.

Sensitivitas yang amat tinggi dan PCR menyebabkan ber-

bagai masalah

(15,25,26)

. DNA kontaminan yang amat sedikitpun

akan ikut tergandakan sehingga terbentuk sejumiah copy dari

DNA kontaminan. DNA kontaminan dapat berasal dari sel dalam

ludah, serpih kulit dari pemeriksa, dan sebagainya. Karena itu

pengerjaan PCR harus benar-benar teliti. Penempelan primer

secara nonspesifik pada segmen DNA non target akan meng-

hasilkan sejumiah copy DNA non target; hal ini dapat dihindari

dengan membuat primer sespesifik mungkin, antara lain dengan

menggunakan oligonukieotid yang tidak terlalu panjang maupun

terlalu pendek dan dengan memasukkan mismatched nucleotide,

misalnya nukieotid 4 dari ujung 3'

(15)

. Pada percobaan dengan

siklus yang amat banyak, misalnya kalau cuplikan DNA terlalu

sedikit, dapat terbentuk dimer dan primer; dimer akan terlihat

sebagai DNA dengan ukuran kira-kira 40 bp, dan biasanya

Cermin Dunia Kedokteran No. 110, 1996 27

mudah dikenali sehingga tidak terlalu mengganggu. Selain

masalah di atas kekurangan aktivitas polimerase dari Taq akan

menyebabkan terjadinya salah baca dan penggabungan basa

yang salah (misincorporation); karena itu polimerase harus di-

tangani dengan amat cermat, misalnya dalam hal penyimpanan

bahan-bahan yang digunakan.

PCR PADA THALASSEMIA

Sebelum cara PCR ditemukan analisis DNA dilakukan

dengan prosedur yang panjang dan rumit, yaitu pertama-tama

membentuk perpustakaan (library construction) melalui digesti

dengan endonuklease restriktif dan kloning, kemudian skrining,

mapping, subkloning dan terakhir sekuensing. PCR dapat me-

nyingkat proses tersebut: dengan PCR, yang masih mengguna-

kan fragmen Klenow, dapat diperoleh fragmen DNA yang lang-

sung dapat disubklon

(27)

. Pada prosedur PCR sekarang, dengan

menggunakan enzim Taq, subkloning tidak diperlukan lagi.

Tipe delesi pada thalassemia- yang terbanyak di Asia

Tenggara adalah

3,4

dan

4,2

. Dengan menggunakan dua

primer satu di hulu dan satu di hilir dan delesi akan dihasil-

kan segmen DNA yang sekian bp lebih pendek daripada normal.

Pada hidrop fetalis Hb Bart tidak terbentuk copy dan gena-

sebagai produk PCR

(18)

. karena penderita sama sekali tidak mem-

punyai gena-. Winichagoon et al. (1989) membuktikan bahwa

PCR mampu mendeteksi delesi hanya sepanjang 4bp pada kodon

41/42 (CTTT) dan gena-

(28)

Untuk mendeteksi mutan, yang merupakan dasar utama

kelainan genetik pada thalassemia- mula-mula segmen tempat

mutasi digandakan dan kemudian dianalisis dengan probe, de-

ngan endonuklease restriksi atau sekuensing. Prosedur yang

praktis untuk mendeteksi mutan secara langsung dari produk

PCR telah dikembangkan, yaitu amplification refractory muta-

tion system (ARMS)

(13,15)

. Pada sistem ini digunakan primer

ARMS, yaitu oligonukleotid terdiri atas 2030 bp yang kom-

plementer dengan DNA mutan (allele specific oligonucleotide =

ASO); nukleotid ujung 3' dan primer ARMS komplementer

dengan nukleotid yang mengalami mutasi. Primer ARMS untuk

mutan tertentu akan merupakan primer atau amplimer bagi

mutan itu saja, dan tidak bagi DNA normal maupun mutan lain,

karena ujung 3' primer ARMS mutan tidak komplementer de-

ngan DNA normal maupun mutan lain. Satu primer ARMS yang

komplementer dengan segmen hilir DNA mutan tertentu ber-

sama dengan satu common primer (yang punya urutan nukleotid

sama dengan segmen DNA target di hulu) akan menggandakan

segmen DNA mutan yang terletak di antara kedua primer ter-

sebut.

Untuk mendeteksi mutasi IVS-1 nt5 (G > C) pada

gena- misalnya, digunakan primer ARMS, 5'

CTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGTTAG 3' dan

common primer 5' ACCTCACCCTGTGGAGCCAC 3'

(15)

Proses PCR digambarkan sebagai berikut (Gambar 3).

Dengan primer di atas akan diperoleh sejumlah besar copy

dari segmen DNA target denganukuran 285 bp, hanya kalau pada

DNA target terdapat mutasi IVS1 ntl (G>C); DNA normal

tidak akan digandakan. Sebaliknya d tabung yang mengan-

dung primer normal yang ujung 3'-nya C (komplementer dengan

Gambar 3. Bagan deteksi mutan dengan prosedur ARMS: a/ penempelan primer ARMS pada DNA target

[gena-b dengan mutasi pada IVS-1 nt-5 (G>C)] dan seterusnya ekstensi primer ARMS > ter-

bentuk DNA yang komplementer dengan DNA target; b/ common primer menempel pada DNA hasil

ekstensi primer ARMS dan seterusnya ekstensi common primer menghasilkan DNA dengan panjang

285

bp.

(c/)

Cermin Dunia Kedokteran No. 110, 1996

ujung 3' DNA normal G), akan terjadi penggandaan DNA nor-

mal, sedangkan penggandaan DNA mutan tidak terjadi. Segmen

DNA yang diperoleh kemudian dideteksi secara elektroforesis

dengan pengecatan etidium bromid.

Gambar 4 memperlihatkan hasil elektroforesis dari produk

PCR dan mutasi IVS1 nt5(G>C)

(15)

Gambar 4. Hasil elektroforesis DNA produk dan ARMS.

0x174\Hae111 dipakai sebagai marker untuk menunjukkan

ukuran fragmen-fragmen. Adanya fragmen dengan ukuran

861 bp pada semua jalur menunjukkan efikasi PCR. Jalur 3,4

dari

kontrol

positif

menunjukkan

produk

dengan

ukuran

285

bp; ini berarti ada mutasi IVS1nt5(G>C). Pada jalur 1, 2, 5

dan

kontrol

negatif

tidak

ada

mutasi

tersebut.

Meskipun prosedur ARMS cukup praktis, tetapi untuk meng-

identifikasi suatu mutan setiap primer ASO harus dicoba sendiri-

sendiri. Untuk mengatasi masalah tersebut Maggio et al. (1993)

menerapkan teknik hibridisasi covalent reverse dot blot (RDB)

dengan hasil sangat akurat

(11)

. Pada teknik ini ASO digunakan

sebagai probe (probe ASO) untuk alel mutan dan probe untuk alel

normal. Bermacam-macam probe ASO bersama dengan probe

normal difiksasikan terpisah-pisah pada lempeng nilon (Biodyne

Cnylon membrane). Pada carik lempeng sebelah atas difiksasikan

sederet probe untuk alel normal dan di sebelah bawahnya sederet

probe ASO untuk bermacam-macam alel mutan. DNA hasil

amplifikasi PCR yang mencakup segmen tempat mutasi yang

dicurigai dipaparkan pada canik lempeng tadi setelah didenatu-

rasi dengan pemanasan, maka akan terjadi hibridisasi DNA tadi

dengan probe yang ada pada lempeng. Alel normal hasil ampli-

fikasi akan mengalami hibridisasi pada deret atas dan lempeng,

sedangkan alel mutasi akan mengalami hibridisasi dengan probe

ASO yang sesuai di deret bawah. Setelah pengerjaan dengan

konyugat streptavidin horseradish peroxidase (HRP) atau avidin

alkaline phosphatase (AP) deteksi warna dilakukan dengan

substrat nitroblue tetrazolium (NBT) untuk AP atau tetrame-

thylbenzidine (TMB) untuk HRP. Pada prosedur RDB di atas

tidak diperlukan bahan radioaktif maupun elektroforesis, se-

hingga mudah dilaksanakan dan relatif murah. Di samping itu

terdapat keunggulan lain, yaitu beberapa primer ASO dapat

digunakan sekaligus, sehingga mutan langsung dapat dibaca

(Gambar 5); canik-carik lempeng yang berisi bermacam-macam

probe ASO yang diperlukan mudah disuplai untuk keperluan

lapangan

(11)

Gambar 5. Hasil reverse dot blot beberapa jenis mutasi

Pada prosedur ARMS maupun hibridisasi RDB, primer

ASO maupun probe ASO mudah disintesis jika pola mutasi dari

populasi yang diteliti sudah diketahui. Primer atau probe ASO

bagi mutan yang sering terdapat merupakan prioritas untuk

disediakan.

MANFAAT PCR

Penggandaan DNA dengan kloning tidak praktis terutama

untuk keperluan diagnosis prenatal yang berlomba dengan

waktu

(18)

, sedangkan PCR hanya memerlukan waktu 3 atau 4

jam, prosedur pengerjaannya seperti melakukan reaksi kimia biasa

dan telah digunakan dalam berbagai penelitian thalassemia

(5,16,29)

Dengan PCR dalam waktu 24 jam sejak pencuplikan vili korialis

(chorionic villous sampling) diagnosis prenatal sudah dapat di-

tegakkan

(18)

Pada studi pola mutasi diperlukan cara yang praktis dan

murah, dalam hal ini PCR dapat memenuhi tuntutan tersebut.

Varawalla et al. (1991) dengan 19 macam primer ARMS dan 5

macam common primer meneliti 702 carrier, yaitu ibu dari bayi

thalassemia- di Subbenua India

(15)

. Dengan primer yang amat

bervariasi tersebut berhasil diidentifikasi 98% genotip dan kasus

yang diteliti. Lima macam mutasi yaitu IVS-1 nt5 (G>C), delesi

619 bp dan ujung 3' gena-, kodon 8/9 (+C), NS-l ntl (G>T),

dan kodon 41/42 (CTTT) merupakan 93,6% dari keseluruhan.

Jenis mutasi tersebut sama dengan yang ditemukan pada imigran

India di Inggris

(13)

. Ini berarti 5 macam primer ARMS untuk

mutan tersebut merupakan primer utama yang perlu disediakan

untuk wilayah Subbenua India atau untuk ras India.

Dengan menggunakan primer ARMS untuk IVS-1 ntl (G

>A), IVS-1 nt5 (G>C) dan kodon 15(G>A) Sofro et al.

(1992) melaporkan jenis mutasi dan penderita thalassemia dan

trait thalassemia dari Yogyakarta dan sekitannya

(14)

. Dari 81

Cermin Dunia Kedokteran No. 110, 1996 29

subyek yang diteliti dapat diidentifikasi jenis mutasi dari 67

subyek dengan frekuensi mutan sesuai dengan hasil penelitian

Lie-Injo et al

(29)

dengan teknik PCR dan probe oligonukleotid

menemukan tipe mutasi berturut-turut dari yang tersering

IVS1ntl (G>C), Kodon 26(HAH>AAG), IVS2nt654(C>T),

IVS1ntl (G>T), Kodon 1 5(TGG>TAG), Kodon 17(AAG>

TAG), Kodon30(AGG>ACG),IVS1ntl(G>A),Kodon 35(C),

Kodon4l/42(CTTT). Berdasarkan penelitian itu, jika teknik

ARMS diterapkan di Indonesia primer yang terutama perlu

disediakan adalah:

5' TTAAACCTGTCTTGTAACCTFGATACGAAG 3' untuk

mutan IVS1 ntl(G>C),

5' GAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTATGGT 3' untuk

mutan IVS2 nt654(C>T),

5' TTAAACCTGTCTTGTAACCTFGATACGAAA 3' untuk

mutan IVS1 ntl(G>T),

5' CCACCAACTTCATCCACGTTCACTTGGCCT 3' untuk

mutan kodon 15(G>A), dan

5' TAACCTTGATACCAACCTGCCCAGGGGCTT 3' untuk

mutan kodon 26(GAG>AAG) atau HbE.

Dengan menggunakan teknik hibridisasi RDB Maggio et al.

(1993) dapat mengidentifikasi sembilan mutasi pada gena-

yang sering terdapat pada populasi Sicilia, berturut-turut dari

yang terbanyak mutasi kodon 39, IVS1nt110, IVS1nt6, IVS1nt1,

mutasi IVS2nt745 dan mutasi nt-87. Persentase dari masing-

masing mutan ternyata sesuai dengan penelitian sebelumnya.

Hal ini menunjukkan keakuratan dari cara tersebut

(11)

Karena prosedur PCR amat praktis maka besar harapan akan

dapat diimplementasikan sebagai prosedur rutin di Indonesia

khususnya untuk diagnosis prenatal bila alternatif pengendalian

thalassemia melibatkan diagnosis tersebut. Apabila polimerase

Taq dan primer/probe dapat ditekan harganya maka biaya tiap

satuan analisis akan tidak mahal

(18)

KESIMPULAN

PCR merupakan cara enzimatik yang sangat sensitif dan

spesifik untuk menggandakan DNA. Dengan ditemukannya

polimerase Taq prosedur ini makin praktis, sehingga kini cara

tersebut telah luas digunakan dan merupakan alternatif yang

praktis untuk memperoleh DNA dalam jumlah yang cukup guna

kepentingan studi molekular, termasuk thalassemia. Berdasar-

kan prinsip PCR telah dikembangkan cara diagnostik molekular

yang terbukti sangat akurat. Dengan prosedur ARMS yang

menggunakan allele specific oligonucleotide sebagai primer

mutan dapat dideteksi secara langsung. Teknik hibridisasi RDB

terhadap DNA produk PCR dengan menggunakan allele specific

oligonucleotide sebagai probe merupakan cara diagnostik

molekular yang relatif mudah. Untuk penyediaan primer maupun

probe yang sesuai bagi populasi atau ras tertentu, macam dan

frekuensi mutasi gena pada populasi yang bersangkutan harus

telah diketahui lebih dahulu.

KEPUSTAKAAN

1. Conconni F, Bargellesi A, Del Senno L, Menegatti E, Pontremoli S. Russo

G. Globin chain synthesis in Sicilian thalassemic subjects, Br J Haematol.

1970; 19: 46975.

2. Friedman SH, Schwartz E, Ahern V, Ahern E. Globin synthesis in the

Jamaican Negro with l-thalassemia, Br J Haematol. 1974; 28: 50513.

3. Todd D, Chan V, Schneider RG, Dozy AM, Kan YW, Chan TK. Globin

synthesis in hemoglobin New York (113

valin>glutamic acid

, Br J Hematol.

1980; 46: 55764.

4. Cheng TC, Orkin SH, Antonarakis SE. Potter MJ, Sexton JP, Markham AF,

Giardina PJV, Li A, Kazazian Jr HH. -thalassemia in Chinese use of in

vivo mRNA analysis and oligonucleotide hybridization in systemic cha-

racterization of molecular defects. USA: Proc NatI Acad Sci 1984; 81:

282125.

5. Chan V, Chan TK, Kan YW, Todd. A novel -thalassemia frameshift

mutation (codon 14/15), detectable by direct visualization of abnormal

restriction fragment in amplified genome DNA. Blood 198; 72: 142023.

6. Fucharoen 5, Kobayashi Y, Fucharoen G, Ohta Y, Miyazono K, Fukimaki

F, Takaku. A single nucleotide deletion in codon 123 of -g1obin gene

causes an inclusion bodies 3-thalassemia trait: A novel elongated globin

chain Makabe. Br J Haematol. 1990; 75: 39399.

7. Romeo L, Almeido L, Higgs DR, Levinha J, Liebhaber SA. -thalassemia

resulting from deletion of regulatory sequences far upstream of the -

globin structural gene Blood 1991; 7: 158995.

8. Wong C, Antonarakis SE, Goff SC, Orkin SH, Forget BG, Nathan DG,

Giardina PJV, Kazazian Jr HH. -thalassemia due to two novel nucleotide

substitutions in consensus acceptor splice sequences of the -globin gene

Blood 1989; 73: 91418.

9. Cal SP, Zhang JZ, Doherty M, Yuet WK. A new TATA box mutation

detected at prenatal diagnosis for -tha1assemia. Hum Genet 1989; 45:

11214.

10. Huang SZ, Zhou XD, Thu H, RenZR, Zeng YT. Detection of-thalassemia

mutations in Chinese using amplified DNA from dried blood specimens,

Hum Genet 1989; 84: 1293 1.

11. Maggio A, Giambona A, Cal SP, Wall J, Kan YW, Chebab FF. Rapid and

simultaneous typing of hemoglobin S, hemoglobin C, and seven Me-

diterranian -thalassemia mutations by covalent reverse dot-blot analysis:

Application to prenatal diagnosis to Sicily, Blood 1993; 81: 23942.

12. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel 5, Scharf Si, Higuchi R, Ham GT, Mullis

KB, Erlich HA. Primer directed enzymatic amplification of DNA with a

thermostable DNA polymerase. Science 1988b; 239: 48791.

13. Old JM, Varawalla NY, Weatherall DJ. Rapid detection and prenatal

diagnosis ofll-thalassemia: studies in Indian and Cypriot populations in the

UK. Lancet 1990; II: 83437.

14. Sofro ASM, Lanni F, Ismadi. Globin gene mutations ofbeta-thalassemiaat

Dr. Sardjito General Hospital Yogyakarta-Indonesia Hum Genet 1992;

51(Y) Supl A: 343.

15. Varawalla NY, Old JM, Sarkar R, Venkatesan R, Weatherall DJ. The

spectrum of 1-thalassemia mutations on the Indian subcontinent: the basis

for prenatal diagnosis. Br J Haematol. 1991; 78: 2427.

16. Nantomi Y, Nakashima H, Kagimoto M, Naito Y, Yokota E, Imamura T.

A common chinese -thalassemia mutation found in a Japanese family.

Hum Genet 1990; 86: 48083.

17. Wang C, Antonarakis SE, Goff SC, Orkin SH, Forget BG, Boehm CD,

Kazazian Jr HH. On the origin of the spread of 1-thalassemia : Recurrent

observation on mutations in different ethnic groups, USA:Pro Natl Acd Sci

1986; 83: 652932.

18. Fucharoen 5, Winichagoon P. Thonglairoam V. Siriboon W, Siritanarakul

N, Kanokpongsakdi S. Vantanasiri V. Prenatal diagnosis of thalassemia

and hemoglobinopathies in Thailand : Experiences from 100 pregnancies

Southeast Asian, J Trop Med Pubi Health 1991; 22: 1629.

19. Vogel F, Motulsky AG. Human Genetics Problem and Approaches 2nd ed.

Berlin: Springer-Verlag, 1986.

20. Fucharoen-Winichagoon P. Fucharoen S. Molecular mechanism of tha-

lassemiain Thailand. Thailand: J Sc Soc 1986; 12: 921.

21. Bunn HF, Forget BG. Hemoglobin : genetic and clinical aspects 1st ed.

Philadelphia: WB. Saunders Co 1986; pp 225305.

22. Rosatelli MC, Oggiano L, Leoni GB, Tuveri T, Di Tucci A, Scalas MT.

Dore E, PistiddaP, Massa A, Longinotti M, Cao A. Thalassemiaintermedia

resulting from a mild -thalassemia mutation Blood 1989; 73: 60105.

23. Kazazian HH, Ginder GD, Snyder PG. Van Beneden Ri, Wodhead AP.

Furtherevidence of quantitative deficiency of chain-specific globin mRNA

Cermin Dunia Kedokteran No. 110, 1996