Cermin Dunia Kedokteran

Identifikasi Intratipik Poliovirus

Djoko Yuwono

Pusat Penelitian Pen yakit Menular, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan

Departemen Kesehatan RI, Jakarta

ABSTRAK

Dalam rangka pelaksanaan Global Eradication Programme on Poliomyelitis tahun

2000, pencegahan Poliomyelitis dengan imunisasi menggunakan vaksin Polio Oral Sabin

telah dilakukan secara menyeluruh hampir di seluruh dunia. Akibat penggunaan vaksin

Polio Oral Sabin itu adalah adanya vaccine strain dan wild strain Poliovirus bersama-

sama di alam, terjadinya rekombinasi antara kedua jenis poliovirus, adanya Vaccine

Associated Poliomyelitis Paralysis (VAPP), sehingga perlu dilakukan identifikasi intra-

tipik poliovirus untuk membedakan vaccine strain dan wild strain.

Tujuan artikel ini adalah

ingin memberikan gambaran secara ringkas mengenai

perkembangan metoda identifikasi poliovirus yang dilakukan dewasa ini.

PENDAHULUAN

Poliomyelitis adalah suatu penyakit menular-akut dan mu-

siman yang menyerang pusat saraf motorik otak di bagian grey

matter. Poliomyelitis disebabkan oleh infeksi poliovirus dan

mengakibatkan terjadinya paralisis, umumnya menyerang anak

balita, oleh karena itu dahulu disebut juga penyakit infantile

paralysis. Penyakit ini diidentifikasi pertama kali oleh Land-

steiner pada tahun 1901, dengan mengisolasi poliovirus dari

kera, namun dari gambar-gambar di piramida diduga penyakit ini

sudah ditemukan pada zaman Mesir kuno. Penyakit ini terdapat

di seluruh dunia, di daerah tropik umumnya terjadi pada musim

hujan, sedang di daerah subtropik lebih sering terjadi pada musim

panas dan awal musim gugur. Yang menjadi masalah adalah

bahwa penyakit ini dapat berakibat cacat seumur hidup, namun

yang menguntungkan adalah bahwa penyakit ini kini telah dapat

dicegah dengan imunisasi. Vaksin yang dipakai saat adalah

vaksin oral trivalen Sabin, yang berisi virus hidup yang telah

dilemahkan (live attenuated vaccine). Adanya vaksin ini menye-

babkan banyak negara maju bahkan beberapa negara berkem-

bang telah mengalami penurunan angka kesakitan dan kematian

akibat poliomyelitis. Dengan situasi seperti inilah maka kini

WHO juga telah mencanangkan program Eradikasi Global

Poliomyelitis dan pada tahun 2000 nanti diharapkan dunia sudah

akan bebas poliomyelitis; bahkan di kawasan Asia Pasifik sudah

ditargetkan bahwa dalam tabula 1995 sudah harus bebas polio-

myelitis

(1,2)

Dengan meningkatnya penggunaan vaksin anti poliomyeli-

tis yang live attenuated ini, maka akan ditemukan virus vaksin

(vaccine strain) dan virus ganas (wild strain) di alam bebas,

namun sebetulnya justru keadaan ini yang merupakan salah satu

keunggulan penggunaan vaksin berisi virus hidup, oleh karena

antara dua jenis virus tersebut saling melakukan interferensi dan

mungkin juga saling melakukan rekombinasi, sehingga dapat

mencegah berkembangnya virus ganas secara alami. Di sisi lain

penggunaan vaksin live attenuated ternyata mempunyai

erugian, walaupun kasusnyalianya dilaporkan 1 dalam setiap 1

juta penggunaan, yaitu terjadinya reverse reaction, suatu keadaan

virus vaksin akan berubah kembali menjadi virus ganas, dan

memang poliomorfisme dapat saja terjadi pada genom virus

vaksin ataupun virus ganas oleh pengaruh faktor lingkungan

(2,3)

Sebetulnya hal inilah yang merupakan masalah mengapa harus

dilakukan identifikasi intratipik terhadap poliovirus, yaitu untuk

mengetahui berapa besar perubahan susunan nukleotida dalam

genom sehingga dapat berakibat pada terjadinya perubahan sifat

antigenik poliovirus

(4,5,6)

Artikel ini bertujuan memberikan gambaran secara garis

besar tentang beberapa metoda identitikasi intratipik terhadap

poliovirus dan kegunaannya bagi eradiksi poliomyelitis dewasa

ini.

STRUKTUR DAN ORGANISASI GENOM POLIOVIRUS

Poliovirus termasuk genus Picornaviridae, mempunyai

simetri kubus ikosahedral, pentamer, dengan diameter 2830

nm, tidak memiliki envelop. Memiliki sifat termosensitif, resis-

ten terhadap pelarut lemak (ether, khloroform), dipengaruhi oleh

guanidin. Mempunyai genom ssRNA yang bersifat polaritas

positif. Genom panjangnya sekitar75(X) bp, yang terdiri dari satu

ORF (open reading frame) yang mengkode 3 buah protein (P1,

P2 dan P3) yang masing-masing mempunyai fungsi berbeda, P1

mempunyai fungsi menyusun unit struktural virus, yang terdiri

dari Viral Protein (VP) ada VPO: VP1: VP2 dan VP3. yang me-

rupakan antigen determinan poliovirus. P2 mempunyai fungsi

protease terdiri dari protein 2A, 2B dan 2C, serta P3 terdiri dari

protein 3A, M. 3C dan 3D mempunyai fungsi reverse tran-

scriptase dan polimerase. Struktur dan organisasi genom Polio-

virus tipe- I (strain ganas Mahoney) telah digambarkan oleh

Kitamura (1981), Racaniello and Baltimore (1981)

(6)

. Toyoda

dkk. juga telah berhasil menggambarkan sekuens genom Polio

tipe-2 dan tipe-3 strain Sabin.

Perbedaan antara Poliovirus tipe-I, tipe-2 dan tipe-3 tidak

begitu besar, ketiganya memiliki persamaan sekuens nukleotida

antara 25%50% (Cumakov, 1979), namun analisis dengan

RFLP oleh Nomoto, dkk (1979), menunjukkan adanya perbe-

daan pola pemotongan dengan enzim restriksi. Hal inilah yang

mendorong Toyoda, dkk (1984) melakukan sekuensing terhadap

genom Poliovirus tipe-2 dan tipe-3 (Sabin), ternyata ditemukan

adanya homologi sekuens sebesar 71%. Perbedaannya terletak

pada 5' NCR sampai pada nukleotida 650760 yaitu pada region

VP4, sehingga digambarkan bahwa ke tiga tipe poliovirus mem-

punyai hubungan genetik yang sangat dekat

(3,7)

Atenuasi wild virus menjadi vaccine virus terletak pada per-

hedaan susunan beberapa nukleotida saja. Misalnya perbedaan

antara Poliovirus tipe-I Sabin dan PI/Mahoney (wild strain)

ternyata terjadi pada daerah 5' Noncoding region dan terletak

pada nukleotida nomor 480, namun pengaruhnya hanya bersifat

fenotip dan sangat lemah

(6)

. Sedangkan perbedaan antara polio-

virus vaksin tipe-2/Sabin dan wild strain P2/Lansing terletak

pada daerah 5' Noncoding Region dan pada region yang mengkode

VPI (kapsid), dan 2A, 2B dan sebagian 2C (non kapsid)

(6)

Demikian pula pada poliovirus tipe-3, dengan menggunakan

strain Poliovirus tipe-3/Sabin dan P3/Leon diketahui bahwa

attenuasi terletak pada daerah 5'Noncoding region pada nukleo-

tida nomor 472 (Cytosin menjadi Urasil) dan terjadinya substi-

tusi asam amino Serine menjadi Phenilalanin pada asam amino

nomor 91 di daerah kapsid

(5,7,8)

. Penelitian Macadam dkk. (1991)

membandingkan sifat genotip dari P2/Sabin dan P2/117 (suatu

Gambar 1. Struktur dan organisasi genom ssRNA poliovirus tipe-1 Mahoney. Menurut Kitamura (1981)

Dikutip dari : Picornaviridae and Their Replication. In Virology 1990. 2

, Ed. Fields et al Eds

strain revertan neurovirulen) terjadi pada region 5' sampai nukleo-

tida nomor 492, dan perbedaannya terletak pada nukleotida

nomor 437 dan 481: terjadinya substitusi nukleotida Adenin

menjadi Guanin

(6)

Pemeriksaan uji neurovirulensi pada otak kera dari strain

virus tersebut ternyata menunjukkan bahwa perubahan susunan

nukleotida tadi dapat menyebabkan terjadinya perubahan sifat

non neurovirulen menjadi neurovirulen kembali; pada beberapa

strain ditemukan telah hilangnya region yang dapat menye-

babkan terjadinya atenuasi sehingga selamanya akan tetap ber-

sifat sebagai wild virus

(6)

. Dengan adanya kenyataan ini terjadi-

nya kasus Vaccine Associated Poliomyelitis Paralysis (VAPP)

tampaknya merupakan masalah yang tidak bisa diabaikan begitu

saja

(9)

IDENTIFIKASI POLIOVIRUS

Sampai saat ini telah diketahui terdapat tiga tipe poliovirus:

Poliovirus tipe-1, strain Burnhilde, Mahoney; Poliovirus tipe-2,

strain Lansing, MEF-2; Poliovirus tipe-3,strain Leon, Saukett,

dan lain-lain.

Untuk mengidentifikasi poliovirus dapat dilakukan dengan

beberapa metoda, namun pada prinsipnya dibedakan sebagai

berikut :

Identifikasi intertipik

Untuk membedakan antara tiga tipe poliovirus tersebut

dengan uji netralisasi terhadap antiserum polio, menggunakan

media kultur jaringan, antara lain sel Vero (sel ginjal kera

Cynomolgus), HEp-2 (human epithelial), RD (sel rhabdosarkoma)

dan kultur jaringan ginjal kera primer (PMK).

Identifikasi intratipik

a) Uji fenotipik

Uji rct-40 marker (reproductive capacity at super optimal

temperature); uji ini sebetulnya hanya dipakai untuk membeda-

kan virus vaksin dan virus ganas dalam pengujian mutu vaksin,

sedangkan untuk penelitian pasca vaksinasi tidak dianjurkan.

Prinsipnya adalah penghitungan titer virus pada intervensi suhu

yang berbeda (biasanya pada suhu 37°C dan 40°C).

NaHCO

(d Marker); prinsipnya adalah pengujian ber-

dasarkan pertumbuhan virus pada konsentrasi NaHCO

yang

berbeda. Strain vaksin tidak dapat berkembang biak pada kon-

sentrasi NaHCO

rendah (pH asam).

McBride test dan Wecker test; prinsipnya adalah peng-

hitungan titer virus setelah dinetralisasikan dengan antiserum

polio poliklonal standar. Strain vaksin akan lebih mudah di-

netralisasi.

Uji Netralisasi terhadap antibodi monoklonal; prinsipnya

adalah reaksi virus dengan suatu baterai (pool) antibodi mono-

klonal. Pola reaksi dengan setiap antiserum menunjukkan tingkat

virulensi virus. Dibutuhkan paling tidak 6 tipe antibodi mono-

klonal, berapa persen virus yang dapat dinetralisasikan oleh

antibodi tersebut menunjukkan tingkat virulensi virus.

b) Uji genotipik

Uji Hibridisasi DNA (finger printing DNA); prinsipnya

probe DNA (pelacak DNA) yang spesifik dapat disisipkan ke

DNA target.

· RELP (Restriction Fragment Length Polymorphisme) analy-

sis.

Prinsipnya harus dihasilkan dulu cDNA dengan cara meng-

amplifikasi cDNA target dengan PCR. PCR products yang

terbentuk didigest (dipotong) dengan menggunakan aktivitas

ensim endonuklease, misalnya Dde I, Hae III dan Hpa II. Pola

restriksi (terbentuknya band) pada gel elektroforesa menunjuk-

kan perbedaan tipe virus baik secara intratipik maupun intertipik.

· Amplifikasi DNA dengan PCR.

Prinsipnya adalah sintesa cDNA poliovirus dari cetakan

RNA poliovirus dengan bantuan ensim reverse transcriptase.

Kemudian dengan menggunakan primer spesifik untuk sekuens

target yang diinginkan misalnya 5' NCR dengan bantuan ensim

DNA Taq polymerise dilakukan amplifikasi sekuens target.

Hasil ini spesifik untuk mengidentifikasi vaksin strain, hasil

amplifikasi tergantung jenis primer yang dipergunakan. Diperlu-

kan banyak primer set, paling tidak 3 primer set, untuk masing-

masing tipe virus.

· Sekuens DNA analisis

PCR produk yang dihasilkan dapat dianalisis dengan meng-

gunakan alat komputer dan hasil urutan sekuens nukleotida dapat

diketahui dengan akurat.

PENELITIAN YANG TELAH DILAKUKAN

Penelitian yang telah dilakukan di berbagai negara menun-

jukkan betapa pentingnya pemantauan poliovirus pasca vaksi-

nasi, seperti misalnya di Amerika Serikat dengan melakukan

pemantauan selama 10 tahun dapat diketahui bahwa ternyata

masih ditemukan adanya kasus paralitik VAPP, selain itu juga

dilaporkan adanya kasus-kasus poliomyelitis yang disebabkan

oleh poliovirus ganas yang merupakan virus impor

(9)

Dengan melakukan identifikasi intratipik secara molekular

dapat diketahui secara tepat di mana letak perubahan genetik itu

terjadi yang berakibat pada proses atenuasi wild virus menjadi

strain vaksin. Hal ini akan sangat berguna untuk kemungkinan

dilakukan perubahan vaksin secara rasional, teknologi pembuat-

an vaksin serta model dalam metodologi pengujian mutu dan

keamanan vaksin

(7,10)

Penggunaan teknik konvensional umumnya dipakai untuk

identifikasi intertipik dan sampai saat ini WHO masih tetap

memberikan rekomendasi untuk penggunaan Uji Netralisasi

terhadap antiserum poliklonal pada media kultur jaringan untuk

mengidentifikasi intertipik poliovirus

(2)

. Sedangkan penggunaan

teknik konvensional untuk identifikasi intratipik poliovirus

(antara lain : McBride test, Wecker test, antibodi monoklonal,

dan lain-lain) ternyata memberikan hasil yang kurang akurat dan

tidak mendetail, tambahan lagi memerlukan ruang dan waktu

yang perlu dipertimbangkan.

Penggunaan teknik RFLP sebetulnya kurang praktis, oleh

karena harus melakukan dua kali pekerjaan, pertama harus

amplifikasi DNA dengan PCR kemudian ke dua melakukan

pemotongan PCR produk dengan menggunakan ensim endo-

nuklease tertentu. Namun keuntungannya adalah pada saat

amplifikasi PCR dapat dipakai suatu primer umum

(11)

Penggunaan teknik amplifikasi DNA dengan PCR ternyata

sangat membantu untuk genotyping poliovirus, terutama untuk

diagnosis cepat. Walaupun diperlukan reagensia yang mahal,

teknologi mutakhir dan tenaga terdidik yang terampil. Hasil ter-

akhir yang diketahui adalah bahwa sampai saat ini identifikasi

genotyping hanya dilakukan untuk vaksin strain saja, dengan

menggunakan primer spesifik ini dapat dihasilkan produk PCR

yang besarnya masing-masing 97bp (P1/Sabin); 71 bp (P2/Sabin)

dan 44bp (P3/Sabin), sedangkan untuk wild strain belum dapat

dilakukan oleh karena harus dibuat suatu desain primer spesifik

untuk wild virus

(4)

Hasil penelitian di daerah kumuh di DKI Jakarta menunjuk-

kan bahwa dengan cakupan imunisasi sebesar 87% ternyata

ditemukan poliovirustipe-1 yang merupakan strain vaksin, dengan

menggunakan teknik rct-40 marker. Adapun hasil identifikasi

virus yang diperoleh adalah sebagai berikut: 3,8% poliovirus

tipe-1 dan tipe-3;20,2% enterovirus; 3,8% adenovirus dan 8,0%

rhinovirus sedangkan Iainnya 64,2% negatif'''. Hasil penelitian

di Amerika Serikat menunjukkan bahwa total ditemukan kasus

VAPP sebesar 8.0/10.000.000 populasi/tahun dan masih ditemu-

kan adanya kasus poliomyelitis yang disebabkan oleh infeksi

virus ganas yang merupakan virus impor

(9)

PENUTUP

Identifikasi intratipik diperlukan untuk membedakan strain

vaksin dan wild strain poliovirus, terutama untuk memantau

Gambar 2. Pola restriksi ensim endonuklease HaeIII, DdeI dan HpaII

terhadap

berbagai

strain

poliovirus

hasil

isolasi.

peredaran poliovirus pasca imunisasi. Oleh WHO dianjurkan

bahwa hanya laboratorium referens saja yang perlu melakukan

identifikasi intratipik poliovirus, terutama yang telah memiliki

sarana laboratorium yang memadai. Sedangkan laboratorium

propinsi cukup dapat melakukan isolasi dan identifikasi inter-

tipik poliovirus saja. Dengan identifikasi intratipik secara biologi

molekular dapat diketahui dengan tepat di region mana terjadi

substitusi nukleotida sehingga berakibat pada terjadinya atenuasi

Gambar 3. Hasil amplifikasi DNA dengan teknik PCR terhadap RNA

poliovirus

Sabin

strain.

Dikutip dari : Chen Fu Yang, et al. Virus Research. 1991. 20: 159-179.

M; Marker. S1; S2; S3: Sabin tipe-1 97bp, tipe-2 71bp dan tipe-

44bp.

Dikutip dari : Balanant J. et al. Virology 1991. 184: 645654.

UC: uncutting.1W: Wild str. Polio-1., S1: Sabin-1. 2W: Wild str.

tipe-2.

2L:

Lansing-2.;

3Le:

Leon-3;

S3:

Sabin-3.

Cermin Dunia Kedokteran No. 100, 1995 19

poliovirus. Hal ini akan sangat berguna dalam melakukan pe-

rencanaan suatu komposisi vaksin secara rasional dan teknologi

produksi vaksin serta metodologi pengujian mutu dan keamanan

vaksin.

KEPUSTAKAAN

1 . NN. Manual for The Virological Investigation of Poliomyelitis. Expanded

Program on Immunization and Division of Communicable Diseases.

WHO/ EPIJCDS/Polio/90.1.

2. Melnick JL. Enteroviruses. In: Virology. Fields BN. et at (eds.) 2nd ed.

New York: Raven Press 1990. p. 549598.

3. Ruckert RR. Picornaviridae and Their Replication. In: Virology. Fields

BM, Knipe DM, (Eds.) 2nd. ed. New York: Raven Press 1990. p. 510514.

4. Chen Fu Yang et at. Detection and Identification of Vaccine Related

polioviruses by The Polymerase Chain Reaction. Virus Research 1991; 20:

159179.

5. Evans DMA et at. Increased neurovirulence associated with a single

nucleotide change in a non coding region of the Sabin type 3 poliovaccine

genom. Nature 1985; 314: 548553.

6. Macadam AJ et at. The 5' noncoding region of the type 2 Poliovirus

Vaccine Strain contains determinants of attenuation and temperature

sensitivity. Virology 1991; 181: 451458.

7. Toyoda H et at. Complete Nucleotide Sequences of all Three Polioviruses

Serotype Genomes. Implication for genetic relationship, gene function and

Antigenic Determinants. J Mol. Biol. 1984; 174: 56185.

8. Westrop GD et al. Genetic Basis of Attenuation of the Polio type 3 Oral

Poliovirus Vaccine. J. Virol. 63:3; 13381344.

9. Strebel PM et al. Epidemiology of Poliomyelitis in the United States One

Decade after The Last Reported Case of Indigenous Wild Virus Associated

Disease. Clinical Infectious Diseases, 1992, 14: 568579.

10. Itoh H. Domestic Production of Oral Poliomyelitis Vaccine. In: Proc

Internat Symp Virus Vaccine in Asian Countries, August. 2527, 1984. p.

7582.

11. Balanant J. The Natural genomic variability of poliovirus analyzed by a

restriction fragment length polymorphism assay. Virology 1991; 184:

645654.

12. Djoko Yuwono. Penyebaran Poliovirus di Daerah Kumuh di DKI Jakarta.

Kumpulan Laporan Penelitian Puslit. Penyakit Menular Badan Litbang

Kesehatan. Departemen Kesehatan RI. 1991.

It's nice to get up early in the morning, but it's nicer to lie in bed

(Sir Larry Lauder)