Cermin Dunia Kedokteran

HASIL PENELITIAN

Aktivitas Antimutagenik

dan Antioksidan Daun Puspa

(Schima wallichii Kort.)

Didi Jauhari Purwadiwarsa*, Anas Subarnas*, Cucu Hadiansyah**, Supriyatna*

*Jurusan Farmasi, ** Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Universitas Padjadjaran, Bandung.

ABSTRAK

Telah dilakukan penelitian mengenai aktivitas antimutagenik dan antioksidan

fraksi butanol daun puspa (Schima wallichii Korth). Hasil pengujian aktivitas anti-

mutagenik secara in vivo dengan metode uji mikronukleus menunjukkan bahwa

pemberian fraksi butanol daun puspa secara oral mampu menurunkan frekuensi sel

eritrosit polikromatik bermikronukleus (MNPCE) dari apusan sumsum tulang paha

mencit jantan galur Swiss-Webster yang diinduksi dengan siklofosfamid dosis 50

mg/kg secara intraperitoneal. Fraksi butanol dosis 300 mg/kg mampu menurunkan

frekuensi MNPCE sebesar 10,51% sedangkan pada dosis 600 mg/kg memberikan

penurunan sebesar 38,27%.

Pada pengujian aktivitas antioksidan secara in vitro dengan metode NBT, fraksi

butanol daun puspa mempunyai penghambatan reduksi NBT oleh superoksida yang

dihasilkan dari reaksi enzimatis xantin dengan bantuan xantin oksidase. Nilai peng-

hambatan reduksi NBT oleh fraksi butanol daun puspa adalah 68,66% pada konsentrasi

200

µg/ml dan 94,37% pada konsentrasi 400 µg/ml.

Dari hasil pengujian tersebut diperoleh kesimpulan fraksi butanol daun puspa

mempunyai aktivitas antimutagenik dan antioksidan.

PENDAHULUAN

Mutasi merupakan perubahan yang terjadi pada gen atau

pada kromosom. Mutasi dapat dikaitkan dengan timbulnya

beragam kelainan, termasuk penyakit kanker. Selain dapat

terjadi secara spontan, mutasi juga dapat diinduksi oleh ber-

bagai faktor seperti radiasi, senyawa kimia tertentu, dan virus.

Faktor-faktor penginduksi mutasi dikenal sebagai mutagen

(1,2)

Salah satu indikator terjadinya mutasi adalah adanya

mikronukleus. Mikronukleus merupakan hasil mutasi dari kro-

mosom utuh yang patah dan kemudian tampak sebagai nukleus

berukuran kecil di dalam suatu sel. Mikronukleus mudah di-

amati pada sel polikromatik eritrosit. Jumlah sel eritrosit

polikromatik bermikronukleus menunjukkan tingkat kerusakan

genetik dalam sistem eritropoitik suatu makhluk hidup

(3)

Banyaknya pengunaan bahan-bahan kimia untuk berbagai

keperluan mengakibatkan peningkatan pencemaran bahan-

bahan kimia berbahaya ke dalam lingkungan hidup. Penelitian

toksikologi memberikan informasi bahwa sebagian besar bahan

kimia yang ada bersifat mutagenik

(1,4)

. Meskipun tubuh kita

sudah dilengkapi berbagai mekanisme pertahanan terhadap

mutagen, peningkatan paparan terhadap bahan-bahan kimia

tersebut dapat meningkatkan peluang terjadinya mutasi. Oleh

karena itu diperlukan suatu zat yang dapat mengurangi risiko

terjadinya mutasi oleh mutagen

(5,6)

Dugaan keterlibatan oksigen reaktif dalam terjadinya

mutasi terutama dalam bentuk radikal bebas akhir-akhir ini

makin mendapat perhatian para peneliti. Radikal bebas merupa-

kan sebutan terhadap molekul yang mempunyai elektron yang

Cermin Dunia Kedokteran No. 127, 2000

tidak berpasangan pada kulit terluarnya, sehingga bersifat

sangat reaktif dan dapat merusak komponen-komponen sel, ter-

masuk asam deoksiribonukleat (DNA)

(7)

. Beberapa laporan

menyebutkan bahwa suatu antioksidan, yaitu senyawa yang

dapat menetralkan radikal bebas juga mempunyai aktivitas

antimutagenik

(5,8,9)

Upaya pencarian zat antimutagenik banyak dilakukan ter-

hadap bahan alam, juga dari tumbuhan. Puspa (Schima

wallichii Korth) merupakan salah satu tumbuhan tropis

Indonesia

(10)

dan termasuk tumbuhan pakan primata. Ekstrak

metanol daun puspa dilaporkan mempunyai aktivitas anti-

promosi tumor dan antimutagenik

(12)

Sebagai kelanjutan dari hasil penelitian tersebut, dalam

rangka usaha mengisolasi senyawa aktif antimutagenik serta

untuk mengetahui kemungkinan adanya aktivitas antioksidan;

maka dilakukan penelitian yang terfokus pada pengujian akti-

vitas antimutagenik dan antioksidan fraksi butanol daun puspa.

BAHAN DAN METODE

Hewan Percobaan

Mencit (Mus musculus) putih jantan galur Swiss-Webster

didapat dari Laboratorium Struktur dan Perkembangan Hewan

Jurusan Biologi FMIPA Universitas Padjadjaran, usia 7-9

minggu, berat 22,5 - 27,5 gram, kandang plastik dengan alas

sekam (4-6 ekor). Suhu ruang hewan percobaan 23-25 °C,

kelembaban 70-85%, dan cahaya diatur dengan regulator 12

jam terang dan 12 jam gelap. Pakan mencit berupa pelet-789

dan minuman dari air ledeng yang masing-masing diberikan

secara ad libitum.

Bahan Kimia

Bahan kimia yang dipakai dalam penelitian ini adalah

fraksi butanol dari ekstrak metanol daun puspa (Hutan

Pangandaran, Ciamis), Siklofosfamid (Wako Pure Chemical

Industries, Ltd. Jepang).

Fraksi butanol pada pengujian aktivitas antimutagenik di-

suspensikan dengan PGA (1% b/v) dalam akuades, sedangkan

pada pengujian aktivitas antioksidan dilarutkan dalam DMSO.

Siklofosfamid dilarutkan dalam larutan NaCl fisiologis.

Ekstraksi dan Fraksinasi

Serbuk daun puspa (650 gram) diekstraksi dengan metanol

(3x24 jam), dan ekstrak metanol kemudian dipartisi dengan

campuran etil asetat - air (3 : 1). Lapisan air diekstraksi dengan

n-butanol sehingga diperoleh lapisan air dan lapisan n-butanol.

Lapisan n-butanol kemudian diuapkan hingga diperoleh fraksi

butanol kering yang akan dipakai dalam pengujian.

Uji Mikronukleas - dengan penginduksi siklofosfamid

Pengujian aktivitas antimutagenik menggunakan metode

uji mikronukleus

(3)

dengan modifikasi. Perlakuan diberikan dua

kali sesuai dengan cara Ghaskadbi dkk.

(5)

Mencit dipuasakan dahulu selama kurang lebih 18 jam.

Setelah pemberian suspensi fraksi butanol secara oral (sebagai

kontrol diberikan suspensi PGA tanpa fraksi butanol), siklo-

fosfamid (50 mg/kg bb., i.p.) disuntikkan pada mencit 30 menit

kemudian. Setelah 24 jam mencit diberi lagi suspensi fraksi

butanol dan siklofosfamid dengan dosis yang sama. Enam jam

setelah pemberian siklofosfamid yang kedua, mencit dibunuh

dengan cara dislokasi leher dan dibedah untuk diambil kedua

tulang pahanya.

Sumsum tulang diaspirasi dengan semprit yang berisi NaCl

fisiologis, selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 1000 rpm

selama sepuluh menit. Sebagian supernatan yang dihasilkan di-

buang dengan menggunakan pipet pasteur, sisanya dibuat pre-

parat apusan pada kaca objek yang kemudian dikeringkan

selama dua hari pada suhu kamar.

Preparat ini diwarnai dengan pewarna Giemsa menurut

cara Gollapudi & Kamra (1979)

(13)

. Dari preparat tersebut

diamati jumlah sel eritrosit polikromatik bermikronukleus

(MNPCE) di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000 kali,

untuk setiap 1000 sel eritrosit polikromatik (PCE). Penghitung-

an dilakukan oleh dua orang dan setiap kelompok perlakuan

menggunakan lima ekor mencit.

Data dianalisis dengan analisis variansi, dan sebaran t-

Student untuk menguji perbedaan antara dua rata-rata.

Uji NBT - sistim xantin/xantin oksidase

Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan metode

Nitroblue Tetrazolium (NBT) dengan kit pereaksi SOD seperti

yang telah dilakukan oleh Murakami dkk. (1996). Kit tersebut

mengandung lima pereaksi (Rl-R5). Rl mengandung buffer

fosfat 0,1 M dengan pH 8, xantin 0,40 mmol/1 dan zat pem-

bentuk warna nitroblue tetrazolium (NBT) dengan kadar 0,24

mmol/l. R2 mengandung enzim xantin oksidase 0,049 unit/ml.

R3 mengandung buffer fosfat 0,1 M dengan pH 8 yang

digunakan untuk melarutkan enzim. R4 merupakan pereaksi

kontrol yang mengandung buffer fosfat 0,1 M pH 8. Sedangkap

R5 adalah penghenti reaksi yang mengandung natrium dodesil

sulfat 69 mmol/1.

Fraksi butanol dibuat sebagai larutan persediaan (LP)

dengan konsentrasi 16 dan 32 mg/ml. Enzim dalam R2 diencer-

kan dengan R3 dengan perbandingan 1:100 (RE). Disediakan

empat kelompok tabung Effendorf (TI - T4) dan dilakukan

prosedur pengujian sebagai berikut, pada suhu di bawah 10

°C.

T1 (sampel) diisi 12,5 ml LP, 250 ml R1, dan 250 ml RE. 72

(blanko) diisi 12,5 ml DMSO, 250 ml R1, dan 250ml RE. T3

(sampel-blanko) diisi 12,5 ml LP, 250 ml R1, dan 250 ml R4.

T4 (blanko-blanko) diisi 12,5 ml DMSO, 250 ml R1, dan 250

ml R4. Keempat tabung Effendorf tersebut serta R5 diinkubasi

pada penangas air dengan suhu 37 °C selama 20 menit. Kemu-

dian dilakukan pengukuran serapan cahaya dengan spektro-

fotometer pada panjang gelombang 560 nm. Pengujian tersebut

dilakukan tiga kali.

Data dinilai dengan menggunakan rumus persen peng-

hambatan reduksi NBT.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Efek fraksi butanol daun puspa terhadap frekuensi

MNPCE

Seperti terlihat pada Tabel l atau Gambar 1, rata-rata

frekuensi MNPCE permil PCE pada kontrol, fraksi butanol

dosis 300 dan 600 mg/kg masing-masing adalah 74,2

± 13,08;

66,4 ± 13,20; dan 45,8

± 13,66. Dengan demikian pemberian

Cermin Dunia Kedokteran No. 127, 2000 19

fraksi butanol daun puspa dosis 300 dan 600 mg/kg masing-

masing memberikan penurunan frekuensi MNPCE sebesar

10,51% dibandingkan. terhadap kontrol. Dari hasil analisis

statistik, dosis 600 mg/kg memberikan efek yang signifikan

(p<0,05). Hasil ini menunjukkan bahwa fraksi butanol daun

puspa dapat menghambat efek mutagenik dari siklofosfamid.

Tabel 1. Nilai rata-rata sel eritrosit polikromatik yang mengandung

mikronukleus (MNPCE) untuk seluruh kelompok perlakuan.

Perlakuan Dosis PCE

MNPCE

MNPCE permil

PCE

Rata-rata

± SD

Kontrol

000

371

74,2

± 13,08

Fraksi butanol

300

5000

332

66,4

± 13,20

Fraksi butanol

600

5000

229

45,8

± 13,66*

* Signifikan, dibandingkan terhadap kontrol (p<0,05)

Tabel 2. Nilai penghambatan reduksi NBT pada pengujian aktivittis

antioksidan berdasarkan serapan cahaya (A) rata-rata dari

blanko (B1), blanko-blanko (B1-B1), sampel (S), dan sampel-

blanko (S-B1) pada panjang gelombang (

) 560 nm.

Serapan cahaya rata-rata

pada 1560 nm

Konsentrasi fraksi

butanol (

µg/ml)

B1-B1

S-B1

Persentase

penghambatan

reduksi NBT

200

0,2840

0,1117

0,217

0,1630

68,66%

400 0,2840

0,1117

0,1647

0,1550

94,37%

Gambar 1. Grafik nilai rata-rata frekuensi sel eritrosit polikromatik ber-

mikronukleus (MNPCE) untuk seluruh kelompok perlakuan

pada pengujian aktivitas antimutagenik. (*Signifikan, diban-

dingkan terhadap kontrol (P<0,05)

Menurut Czyzewska & Mazur (1995)

(15)

siklofosfamid

menginduksi pembentukan mikronukleus melalui metabolit

aktifnya yang bersifat pengalkilasi, yaitu mustard fosforamida,

akrolein, dan 4-hidroksisiklofosfamid. Senyawa pengalkilasi

tersebut dapat berikatan dengan berbagai gugus fungsi kom-

ponen sel, termasuk terhadap basa-basa DNA. Selain itu dapat

juga terjadi peristiwa pindah silang (cross-linkung) DNA.

Reaksi reaksi tersebut antara lain mengakibatkan patahan rantai

DNA yang diduga menyebabkan terjadinya patahan kromosom

dan dapat terlihat sebagai mikronukleus. Metabolisme siklo-

fosfamid juga dilaporkan menyebabkan peningkatan radikal

anion superoksida dan hidroksil

(16)

yang mungkin ikut berperan

dalam menginduksi pembentukan mikronukleus. Senyawa aktif

antimutagenik yang terdapat pada fraksi butanol daun puspa ini

belum diketahui secara pasti, diduga termasuk ke dalam se-

nyawa fenolik yang mekanisme aktivitas antimutageniknya

mungkin berkaitan dengan aktivitas antioksidan

(12)

Gambar 2. Grafik nilai penghambatan reduksi NBT pada pengujian

aktivitas antioksidan.

Efek fraksi butanol daun puspa terhadap reduksi NBT

Seperti terlihat pada Tabel 2 atau Gambar 2, fraksi

butanol daun puspa pada konsentrasi 200 dan 400 mg/ml mem-

punyai nilai persentase penghambatan reduksi NBT oleh super-

oksida dari reaksi enzimatis xantin dengan bantuan xantin

oksidase masing-masing sebesar 68,66° dan 94,37%. Hasil ini

menunjukkan bahwa fraksi butanol daun puspa mempunyai

aktivitas antioksidan seperti superoksida dismutase (SOD).

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil pengujian mikronukleus secara in vivo

dan pengujian NBT secara in vitro, diambil kesimpulan bahwa

fraksi butanol daun puspa mempunyai aktivitas antimutagenik

dan antioksidan.

KEPUSTAKAAN

1. Moutschen, J. Introduction to Genetic Toxicology. New York : John

Wiley & Son; 1985.

2. Mulyadi. Kanker, Karsinogen, Karsinogenesis dan Antikanker. Edisi I.

Yogyakarta: PT. Tiara Wacana; 1996.

Schmid, W. The micronucleus test. Mutation Res. 1975; 31, 9-15.

Wild, D. Cytogenetic effects in the mouse of 17 chemical mutagens and

carcinogens evaluated by the micronucleus test 1978; 56 : 319-27.

5. Ghaskadbi, S., Rajmachikar S, Agate C, Kapadi AH., Vaidya VG.

Modulation of cyclophosphamide mutagenicity by vitamin C in the vivo

rodent micronucleus assay. Teratogenesis, Carcinog. Mutagen 1992; 12,

11-3.

Kong Z, Liu Z, Ding B. Study on the antimutagenic effect of pine needle

extract. Mutation Res. 1995; 347, 101-4.7.

7. Halliwell B. Free radicals, antioxidants, and human disease : curiosity,

Cermin Dunia Kedokteran No. 127, 2000

cause, or consequence? Lancet, 1994; 344 : 721-4

13. Gollapudi B, Kamra OP. Application of a simple Giemsa-staining method

in the micronucleus test. Mutation Res. 1979; 64, 45-6.

8. Shiraki M, Hara Y, Osawa T, Kumon H, Nakayama T, Kawakishi S.

Antioxidative and antimutagenic effect of theaflavin from black tea.

Mutation Res. 1994; 323 ; 29-34.

14. Murakami A, Ohura S, Nakamura Y, Koshimizu K, Ohigashi H. I'-

acetoxychawicol acetate, a superoxide anion generation inhibitor,

potently inhibits tumor promotion by 12-O-tetradecanoylphorbol - 13

-acetate in ICR mouse skin. Omcology 1996; 53 : 389-91.

9. Rompelberg CJM, Stenhuis WH, de Vogel N, van Osenbruggen WA,

Schouten A, Verhagen H. Antimutagenicity of eugenol in the rodent bone

marrow micromucleus test. Mutation Res. 1995; 346 : 69-75.

15. Czyzewska A, Mazur L. Supressing effect or WR-2721 on micronuclei

induced by cyclophosphamide in mice. Teratogenesis, Carcinog. Mutagen

1995; 15 : 109-14.

10. Heyne K. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid III. Jakarta: Yayasan

Sarana Wana Jaya. 1987; 1367.

11. Koshimizu K, Murakami A. Hayashi H,Ohigashi H, Subarnas A,

Gurmaya KJ, Ali AM. Biological activities of edible and medicinal plant

from Indonesia and Malaysia 1998; submission,to publication.

16. Ramu K, Perry CS, Ahmed T, Pakenham G, Kehrer JP. Studies on the

basis for the toxicity of acrolein mercapturates. Toxicol. Appl.

Pharmacol, 1996; 140 : 487-98.

12. Pramana N. Aktivitas Antimutagenik Ekstrak Metanol Daun Puspa

(Schima wallicihii Korth.) dan Fraksi-fraksinya dengan uji Mikronukleus

pada Tikus Wistar. Skripsi. Jurusan Farmasi FMIPA Universitas

Padjadjaran Bandung 1998.

17. Wagner H, Lacaille-Dubois MA. Recent pharmacological results on

bioflavonoids. In S. Antus, M. Gabor & K. Vetschera (Eds) : Flavonoids

and bioflavonoids. Vienna : 9

Hungarian Bioflavonoids Symposium

1995; 53-7.

70% terumbu karang di Indonesia rusak

40% rusak berat.

Tinggal sekitar 7% yang masih sangat bagus.

Semua karena :

- ketidak tahuan manusia dan

- kerakusan ulah manusia !

Cermin Dunia Kedokteran No. 127, 2000 21