Cermin Dunia Kedokteran

HASIL PENELITIAN

Patogenisitas Isolat

B. thuringiensis setelah Dikeringkan

pada Suhu Dingin (Lyophilisasi)

terhadap Jentik Aedes aegypti

di Laboratorium

Blondine Ch.P, Umi Widyastuti

Stasiun Penelitian Vektor Penyakit, Pusat Penelitian Ekologi Kesehatan

Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan RI, Salatiga

ABSTRAK

Suatu upaya telah dilakukan untuk mengetahui patogenisitas isolat Bacillus thu-

ringiensis setelah dikeringkan pada suhu dingin (lyophilisasi) terhadap jentik nyamuk

Aedes aegypti instar III di laboratorium.

Bacillus thuringiensis israelensis (H-14) yang diproduksi oleh Abbott, dengan

nama dagang Vectobac 12 AS sebagai bahan pembanding, diuji dengan cara yang

sama dengan kelima isolat tersebut.

Hasil pengujian patogenisitas 5 isolat B. thuringiensis terhadap jentik nyamuk Ae.

aegypti instar III, menunjukkan bahwa isolat 44TK mampu membunuh 50 dan 90%

jentik nyamuk tersebut dengan konsentrasi paling rendah dibandingkan dengan isolat-

isolat lain pada 24 jam pengujian (LC50=13,69 ml/100 ml dan LC90=37,84 ml/100ml)

maupun 48 jam pengujian (LC50=11,95 ml/100 ml dan LC90=36,69 ml/100 ml).

Isolat 44 TK membutuhkan konsentrasi 7469 sampai 12230 kali lebih besar di-

bandingkan dengan B. thuringiensis israelensis (H-14), untuk membunuh 50 dan 90%

jentik nyamuk Ae. aegypti instar III.

PENDAHULUAN

Bacillus thuringiensis merupakan salah satu bakteri pato-

gen serangga yang sekarang sudah dikembangkan menjadi

salah satu bioinsektisida yang potensial. Salah satu karakteristik

dari B. thuringiensis adalah dapat memproduksi kristal protein

di dalam sel bersama-sama dengan spora, pada waktu sel meng-

alami sporulasi

(1)

Bacillus thuringiensis bersifat kosmopolitan, antara lain di-

temukan pada tanah, soil aquatic system, tempat perindukan

jentik nyamuk ataupun pada jentik nyamuk yang sakit

(2)

Laboratorium jazad hayati Stasiun Penelitian Vektor Pe-

nyakit (SPVP), telah berhasil mengisolasi B. thuringiensis dari

tanah dan jentik nyamuk

(3,4)

. Akan tetapi pemeliharaan isolat B.

thuringiensis yang ditemukan cukup kompleks karena me-

nyangkut media, suhu dan pH penyimpanan. Beberapa kultur

bakteri sudah dapat disimpan selama 10 tahun dalam bentuk

kering, sedangkan B. thuringiensis yang telah di "lyophilisasi"

dapat disimpan selama 15 tahun tanpa kehilangan perubahan

warna

(5)

. Banyak metoda yang digunakan untuk pengeringan

kultur B. thuringiensis misalnya pengeringan spora pada kertas

filter, pengeringan suspensi kultur dalam laktose atau dalam

bentuk kering yang bebas lemak dan susu

(5)

Dalam penelitian ini kultur isolat B. thuringiensis akan

dipelihara dalam bentuk lyophilisasi. Berdasarkan hal tersebut

di atas, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui patogenisitas

isolat B. thuringiensis setelah dikeringkan pada suhu dingin

(lyophilisasi) terhadap jentik nyamuk Aedes aegypti instar III di

laboratorium.

Disajikan pada Seminar Hasil Penelitian Rutin Stasiun Penelitian Vektor

Penyakit 1996/1997, 24-25 Pebruari 1997 di Salatiga

Cermin Dunia Kedokteran No. 131, 2001

METODOLOGI PENELITIAN

A) Bahan

Jazad hayati yang diteliti adalah 5 isolat B. thuringiensis

yang telah di lyophilisasi di laboratorium Mikrobiologi Univer-

sitas Kristen Satya Wacana, Salatiga. Sebelum di lyophilisasi

isolat-isolat tersebut telah diuji patogenisitasnya menurut

metoda Chilcott & Wigley (1988)

(6)

. Sebagai pembanding

adalah B. thuringiensis israelensis (H14) yang diproduksi oleh

Abbott, dengan nama dagang Vectobac 12 AS, USA.

Jentik nyamuk vektor yang digunakan dalam penelitian ini

adalah Ae. aegypti, hasil koloni laboratorium.

B) Pelaksanaan

Proses lyophilisasi dilakukan menurut metoda Dulmage et

al (1990)

(5)

. Lima isolat (8TC, 12TL, 22TP, 43TG, dan 44TK)

B. thuringiensis yang ditemukan, diperbanyak dengan cara

membuat kultur pada media NYSMA miring, dan diinkubasi

pada suhu 30°C. Masing-masing isolat diperbanyak menjadi 10

isolat. Pada umur 4 hari kultur dipanen dengan memakai larut-

an garam faal (NaCl 0,85%) steril dan dimasukkan ke dalarn

tabung sentrifus steril. Hasil panenan di sentrifus dengan kece-

patan 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan dibuang hingga

yang tertinggal adalah pelet. Ke dalam tabung sentrifus

ditambahkan lagi larutan NaCl 0,85% secukupnya dan sekali

lagi disentrifus dengan kecepatan dan waktu yang sama.

Supernatan dibuang lagi sehingga yang tertinggal pelet. Ke

dalam tabung sentrifus ditambahkan larutan NaCl secukupnya.

Kemudian dengan menggunakan pipet Pasteur suspensi kultur

yang akan di lyophilisasi dipindahkan ke dalam tabung

lyophilisasi dan ditempatkan dalam tempat pengeringan yang

bersuhu -50°C. Kemudian dikeringkan selama 12-24 jam. Apa-

bila pengeringan telah selesai, tabung-tabung lyophilisasi di-

ambil dan dimasukkan ke dalam stoples plastik yang berisi

silicagel, dan disimpan dalam refrigerator (- 4°C) sampai

digunakan.

Pengujian patogenisitas di laboratorium dilakukan menurut

prosedur WHO (1985)

(7)

, untuk mendapatkan konsentrasi isolat

B. thuringiensis efektif (LC50 & LC90) dalam membunuh

jentik nyamuk Ae. aegypti.

Larutan stok dibuat dengan cara menambahkan 1 gram

isolat B. thuringiensis yang telah di lyophilisasi ke dalam

Erlenmeyer berukuran 250 ml, dengan 100 ml Tryptose Phos-

phate Broth (TPB). Inkubasi pada temperatur 30°C selama 48

jam. Kemudian dikocok (shake) pada temperatur kamar selama

48 jam. Sesudah 48 jam, dari larutan stok ini dibuat seri peng-

enceran sampai diperoleh konsentrasi yang dibutuhkan (dalam

ml/100 ml). Pengujian dilakukan dengan menggunakan mang-

kok plastik yang diisi dengan 100 ml aquadest dan 20 ekor

jentik nyamuk Ae. aegypti instar III akhir. Masing-masing

konsentrasi pengujian diulang sebanyak 3 kali. Sebagai kontrol,

mangkok plastik hanya diisi dengan 100 ml aquadest dan 20

ekor jentik nyamuk Ae. aegypti. Pengamatan kematian jentik

nyamuk dihitung selama 24 dan 48 jam pengujian.

Sebagai pembanding untuk pengujian isolat B. thuringien-

sis hasil isolasi laboratorium jazad hayati SPVP, digunakan B.

thuringiensis israelensis (H-14) dengan nama Vectobac 12 AS,

USA

(8)

Larutan stok dibuat dengan cara menambahkan 1 gram B.

thuringiensis israelensis yang telah di lyophilisasi ke dalam

Erlenmeyer berukuran 250 ml yang sudah diisi dengan 100 ml

TPB. Inkubasi pada temperatur 30°C selama 48 jam. Kemudian

dikocok (shake) pada temperatur kamar selama 48 jam. Se-

sudah 48 jam, dari larutan tersebut diambil 0,1 ml dan ditambah

dengan 99,9 ml aquadest. Dari larutan stok ini selanjutnya

dibuat seri pengenceran sampai diperoleh konsentrasi yang

dibutuhkan. Prosedur selanjutnya sama dengan pengujian isolat

B. thuringiensis di laboratorium.

Untuk menentukan nilai LC50 dan LC90 digunakan ana-

lisis probit

(9)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil pengujian patogenisitas isolat B. thuringiensis setelah

di lyophilisasi terhadap jentik nyamuk vektor Ae. aegypti instar

III disajikan pada Tabel 1.

Tabel 1. Patogenisitas isolat B. thuringiensis setelah di lyophilisasi ter

hadap jentik nyamuk Ae. aegypti instar III di laboratorium.

Jentik nyamuk Ae. aegypti instar III

Isolat

24 jam

48 jam

LC 50

(ml/100 ml)

LC 90

(ml/100 ml)

LC 50

(ml/100 ml)

LC 90

(ml/100 ml)

8 TC

52,98

105,95

38,50

77,00

12 TL

28,59

57,17

22,53

45,05

22 TP

34,20

68,39

16,67

37,33

43 TG

17,13

62,88

14,32

49,83

44 TK

13,69

37,84

11,95

36,69

Bti (H-14)

0,0016

0,0031

0,0016

0,0030.

Hasil analisis probit menunjukkan bahwa isolat 44TK

mampu membunuh 50 dan 90% jentik nyamuk Ae. aegypti

dengan konsentrasi paling rendah, dibandingkan dengan isolat-

isolat yang lain. Patogenisitas isolat 44TK, selama 24 jam

pengujian, menunjukkan bahwa konsentrasi 13,69 dan 37,84

ml/100 ml, mampu membunuh jentik nyamuk Ae. aegypti ber-

turut-turut sebesar 50% dan 90%. Sedangkan pada 48 jam

pengujian, dibutuhkan sebesar 11,95 dan 36,69 ml/100 ml.

Isolat tersebut dibandingkan dengan B. thuringiensis

israelensis (H-14), maka Bti jauh lebih efektif membunuh 50%

dan 90% jentik nyamuk Ae. aegypti. Nilai LC50 dan LC90

isolat 44TK ternyata 7469 sampai 12230 kali lebih besar di-

bandingkan dengan pembanding Bti yaitu LC50=0,0016

ml/100 ml dan LC90=0,0031 ml/100 ml pada 24 jam peng-

ujian. Pada 48 jam pengujian nilai LC50=0,0016 ml/100 ml

dan LC90=0,0030 ml/100 ml. Melihat hasil yang diperoleh,

maka penelitian ini perlu dilanjutkan dengan cara meningkat-

kan konsentrasi isolat B. thuringiensis sehingga diharapkan

dapat diperoleh isolat yang mempunyai konsentrasi mendekati

standar (pembanding Bti). Selain itu dilanjutkan dengan peng-

ujian patogenisitas isolatisolat setelah di lyophilisasi selatna 1

minggu, 2 minggu, 3 minggu dan seterusnya, dengan tujuan

untuk mengetahui efektivitas dari isolat-isolat tersebut. Hasil

pengujian patogenisitas berbagai isolat B. thuringiensis ter-

hadap jentik nyamuk Ae. aegypti sangat bervariasi, karena

adanya berbagai macam faktor yang dapat mempengaruhi

Cermin Dunia Kedokteran No. 131, 2001 11

patogenisitas isolat-isolat tersebut. Salah satu faktor adalah

perbedaan serotipe di antara isolat isolat yang diuji, dapat

mempengaruhi patogenisitasnya. Misalnya B. thuringiensis

serovar israelensis, menunjukkan patogenisitas tinggi terhadap

jentik nyamuk, dibandingkan dengan 13 serotipe lain yang

menunjukkan patogenisitas tinggi terhadap jentik Lepidop-

tera

(10)

. Oleh karena itu test serologi dari isolat-isolat tersebut

perlu dilakukan untuk mengetahui serotipenya. Selain itu pato-

genisitas dapat dipengaruhi oleh kebiasaan dan perilaku makan

jentik, formulasi (khususnya tingkat pengendapan/sedimentasi)

serta adanya toksin di daerah makan jentik (larval feeding

zone)

(11)

. Berdasarkan faktor daerah makan jentik (larval feed-

ing zone), jentik Ae. aegypti biasa mengambil makanan di

dasar dan dinding penampungan air

(12)

KESIMPULAN

Isolat B. thuringiensis (44TK) mampu membunuh jentik

nyamuk Ae. aegypti instar III dengan konsentrasi paling ren-

dah dibandingkan dengan isolat-isolat yang lain (LC50=13,69

ml/100 ml dan LC90=37,84 ml/100 ml pada 24 jam pengujian,

LC50=11,95 ml/100 ml dan LC90=36,69 ml/100 ml pada 48

jam pengujian).

Untuk membunuh 50% dan 90% jentik nyamuk Ae. Ae-

gypti dibutuhkan konsentrasi isolat 44TK, 7469 sampai 12230

kali lebih besar dibandingkan dengan B. thuringiensis israel-

ensis.

Penelitian perlu dilanjutkan, sehingga dapat diperoleh

konsentrasi strain lokal yang mendekati standar intemasional.

UCAPAN TERIMA KASIH

Kami mengucapkan terima kasih kepada DR. Sustriayu Nalim, Pjh.

Kepala Stasiun Penelitian Vektor Penyakit yang telah membimbing dan

memberi saran-saran sehingga selesainya makalah ini. Ucapan terima kasih

juga kami sampaikan kepada rekan-rekan di laboratorium jazad hayati SPVP

atas bantuan yang yang diberikan.

KEPUSTAKAAN

Ali AS. Analisis Strain Bacillus thuringiensis secara serologi: Kumpulan

Makalah Seminar Bacillus thuringiensis. Jakarta, 20 Januari. 1994. 12h.

Lee HL. Isolation and evaluation of two isolates of Bacillus thuringiensis

for the control of mosquitoes of public health importance in Malaysia.

Mosq. Borne. Disease. Bull. 1998; 5(3-4): 39-47.

3. Blondine Ch.P, Widyastuti U.Isolasi Bacillus thuringiensis dari tanah

pada pohon di Kotamadya Salatiga. Pros Seminar Ilmiah dan Kongres

Nasional Biologi X. Bogor. 1991.

4. Blondine Ch.P, Widyastuti U, Widiarti. Isolasi Bacillus thuringiensis

dari larva dan pengujian patogenisitaspya terhadap larva nyamuk vektor.

Bull. Penelit. Kes. 1992; 20(3): 20-4.

Dulmage T, Yousten AA, Singer S, Lacey LA. Guidelines for Production

of Bacillus thuringiensis H-14 and Bacillus sphaericus. 1990. UNDP/

WORLD BANK/WHO. 58p.

6. Chilcott CN, Wigley PJ. Technical note: an improved method for

differential staining of Bacillus thuringiensis crystals. Letters in Appl

Microbiol 1998; 7: 67-70.

7. WHO. Informal consultation on the development of B. sphaericusas a

microbial larvicide. TDR/BCV/Sphaericus/85.1985; 3: 1-24.

8. Anonim.

Testing

protocol:

Laboratory Bioassay for vectobac Bacillus

thuringiensis israelensis.

Finney DJ. Probit analysis 3

ed. Cambridge University Press, London.

1971.

10. WHO. Data sheet on the biological control agent Bacillus thuringiensis

serotype H-14. WHO/VBC/79. 750. 1979. 13p.

11. Aly C, Mula MA, Xu Bo-Zhao, Schnetter W. Rate of ingestion by

mosquito larvae (Diptera, Culicidae) as a factor in the effectiveness of a

bacterial stomach toxin. J. Med. Entomol. 1988; 25(3): 191-196.

12. Becker N, Djakaria S, Kaiser A,Zulhasril O, Ludwig HW. Efficacy of a

new tablet formulations of an Asporogenous strain of Bacillus

thuringiensis israelensis against larvae of Aedes aegypti. Bull. Soc.

Vector Ecol. 1991; 16(1): 1-7.

Cermin Dunia Kedokteran No. 131, 2001