/srv/www/portalkalbe/files/cdk/files/07_177Perananhipermetilasidnakanker.pdf/07

254

| MEI - JUNI 2010

PENDAHUlUAN

Kanker merupakan proses yang me-

libatkan banyak faktor baik faktor ge-

netik maupun faktor lingkungan yang

multi-kompleks. Perubahan dari sel

normal menjadi sel kanker (proses

transformasi) diakibatkan oleh peruba-

han struktur/mutasi DNA, ekspresi/

transkripsi mRNA, dan fungsi protein

yang melibatkan beberapa gen. Gen

gen pencetus kanker sebagai faktor

penting yang mengatur kondisi dalam

tubuh secara internal mulai dipelajari

mendalam. Kanker dapat dipicu oleh

ekspresi onkogen (gen pendukung

transformasi sel normal menjadi sel

kanker), atau tidak aktifnya gen yang

berperan sebagai penghalang atau

penekan pertumbuhan kanker (tu-

mor suppressor genes), serta kelainan

pada gen yang berperan pada perbai-

kan DNA (DNA repair genes)

(1, 2)

METIlASI DNA DAN EKSPRESI GEN

Sejumlah penelitian mulai mempela-

jari bahwa aktivasi dan inaktivasi gen

yang berperan dalam kanker, salah sa-

tunya akibat proses metilasi DNA pada

gen tersebut. Metilasi sebagai proses

epigenetik tidak mengubah sekuens

DNA bila dibandingkan dengan mu-

tasi yang menyebabkan terjadinya pe-

rubahan struktur DNA. Metilasi meru-

pakan salah satu modifikasi pada DNA

dengan cara penambahan gugus metil

pada posisi ke -5 dari basa sitosin oleh

enzim DNA metiltransferase (DNMTs)

dengan menggunakan donor dari S-

adenosil M-metionin (SAM)

(1)

. Proses

ini umumnya terjadi pada Sitosin (C)

dari CpG dinukleotida di daerah CpG

island. CpG nukleotida adalah untaian

pendek DNA yang banyak mengand-

ung basa sitosin (C) dan basa guanin

(G). Bila persentase CpG dinukleotida

lebih dari atau sama dengan 55 %

maka disebut sebagai CpG island.

Metilasi pada CpG island terjadi se-

lama fase embrionik dan akan dikon-

trol secara teliti setelah memasuki fase

pertumbuhan

(3)

Ada kalanya, metilasi DNA juga ikut

berperan dalam mutasi di suatu untaian

DNA. Proses deaminasi menyebabkan

sitosin berubah menjadi urasil (C U).

Perubahan atau mutasi pada DNA ini

dapat diperbaiki oleh agen perbaikan

DNA. Pada kasus metilasi DNA, sitosin

termetilasi (me5C) akan berubah men-

jadi timin (me5C T) dengan adanya

deaminasi. Mesin mesin untuk per-

baikan DNA tidak dapat mengenali

timin sehingga secara tidak langsung

mutasi yang terjadi pada sekuen DNA

tersebut tidak dapat diperbaiki

(1)

Hambatan ekspresi gen akan terjadi

bila metilasi terjadi di bagian promo-

tor gen tersebut. Metilasi yang ter-

jadi di daerah selain promotor tidak

akan menghentikan transkripsi gen

walaupun di daerah tersebut banyak

mengandung CpG Island. Inaktivasi

juga tidak terjadi secara langsung

akibat metilasi melainkan karena

adanya penempelan sejumlah protein

di bagian promotor gen tersebut

(4, 5)

Pada sel yang normal, sebagian besar

daerah di sekitar CpG islands dimeti-

lasi sedangkan bagian CpG islands di

bagian promotor gen tidak dimetilasi

sehingga memungkinkan proses tran-

skripsi tetap berjalan. Pada sel kanker

terjadi hal yang sebaliknya, CpG is-

lands pada promotor gen dimetilasi

sehingga terjadi inaktivasi gen

(1)

Peranan Hipermetilasi DNA pada Kanker

Putri Y. Suyanto, Ahmad R. Utomo, Ferry Sandra

Cancer Division, Stem Cell and Cancer Institute,

Kalbe Pharmaceutical Company, Jakarta, Indonesia

ABSTRAK

Studi berkelanjutan mengenai sejumlah gen yang diduga menjadi inaktif pada kanker membawa pemahaman baru

tentang konsep hipermetilasi yang terjadi pada promotor tumor suppressor genes seperti cyclin dependent kinase

inhibitor 2A (CDKN2A), E-cadherin (CDH1), human mismatch repair gene (MLH1), dan retinoblastoma1 (Rb1). Meti-

lasi merupakan salah satu proses epigenetik yang memungkinkan terjadinya perubahan ekspresi gen tanpa merubah

sekuens DNA sehingga DNA termetilasi dapat digunakan sebagai penanda kondisi dan tahap dari kanker dengan

gabungan pemeriksaan menggunakan teknik IHC. Sejumlah penelitian menunjukkan bahwa hipermetilasi pada promo-

tor tumor suppressor genes berkorelasi dengan aggresivitas dan buruknya prognosis dari sejumlah kanker. Sejumlah

senyawa kimia agen demetilasi yang bekerja sebagai analogi nukleosida seperti 5-Azacytidine, 5-aza-2'-deoxycytidine,

dan Zebularin terbukti mampu menghambat enzim DNMTs dan mengaktivasi kembali gen gen yang inaktif karena

hipermetilasi pada kanker.

Kata-kata kunci : hipermetilasi, kanker, inaktivasi, tumor suppressor gene

TINJAUAN

PUSTAKA

CDK ed_177 mei ok.indd 254

4/26/2010 10:53:45 AM

255

| MEI - JUNI 2010

Hipermetilasi promotor DNA dan

Inaktivasi Tumor Suppressor Genes

pada Kanker

Metilasi DNA pada tumor suppres-

sor genes di sel normal dapat me-

nyebabkan transformasi sel ke arah

sifat malignant karena hilangnya sifat

alami untuk kontrol pertumbuhan. Se-

jumlah penelitian menunjukkan bahwa

peningkatan mRNA dan biosintesis

protein DNMT1 dan DNMT3B pada

sejumlah tipe kanker berkorelasi de-

ngan hipermetilasi CpG Island yang

berlokasi pada bagian promotor dari

beberapa tumor suppressor genes

seperti cyclin dependent kinase inhibi-

tor 2A (CDKN2A), E-cadherin (CDH1),

human mismatch repair gene (MLH1),

dan retinoblastoma1 (Rb1)

(6)

. Over-

ekspresi DNMT1 dan DNMT3B pada

kanker payudara di manusia berkore-

lasi dengan peningkatan aggresivitas

dari kanker payudara

(7)

. Mekanisme

inaktivasi tumor suppressor genes

yang dikenal dengan Knudson's two-

hit hypothesis menyatakan bahwa

tidak berfungsinya tumor suppressor

genes membutuhkan (1) first hit de-

ngan hilangnya fungsi gen tersebut

di salah satu kopi kromosom melalui

mutasi yang diturunkan (hereditary,

or germline mutation), (2) second hit

dengan hilangnya daerah kromosom

di sel somatik yang mengandung kopi

yang lain dari gen tersebut (Loss of

Heterozygosity or LOH)

(1, 3)

. Dengan

ditemukannya proses metilasi di tu-

mor suppressor gene, maka metilasi

pun bisa menjadi faktor second hit.

Dengan demikian, syarat Knudson Hy-

pothesis terpenuhi dalam menginak-

tivasi gen tersebut, ketika salah satu

dari kopi kromosom sudah termutasi

atau sudah mengalami LOH.

Ada dua dugaan mekanisme peng-

hambatan transkripsi melalui metilasi

pada promotor DNA

(1, 7)

. Mekanisme

pertama menyatakan bahwa metilasi

DNA menghambat secara langsung

melalui pengikatan faktor transkripsi

seperti AP-2, c-Myc, E2F dan NFkB

pada binding site dalam sekuen pro-

motor. Pada mekanisme ini, CpG Is-

land berada di dalam sekuen promo-

tor. Mekanisme represi yang kedua

menyatakan terjadi pengikatan pro-

tein spesifik untuk metilasi DNA pada

CpG dinukleotida. Metilasi DNA

membutuhkan protein m

CpG-binding

(MeCP) dan m

CpG-binding domain

(MBD) yang akan menempel pada

DNA termetilasi dan akan mencegah

terjadinya transkripsi

(7)

Sejumlah penelitian menunjukkan

bahwa hipermetilasi dan inaktivasi

transkripsi ditemukan pada 33 % kasus

kanker payudara, 60 % kanker prostat,

23 % sel karsinoma dari ginjal, dan 92

% cell line dari kanker kolon

(8)

. Gen

gen yang mengalami hipermetilasi

pada sejumlah kasus kanker dapat di-

lihat pada tabel 1.

(6, 9, 10)

Hipermetilasi DNA dan Deteksi

Kanker

Besarnya peranan metilasi pada proses

gene silencing dari tumor suppressor

genes di berbagai kasus kanker mem-

bawa pada suatu pemikiran, bahwa

terjadinya metilasi bisa digunakan un-

tuk mendeteksi kanker. Metilasi DNA

terjadi pada tahap awal dari pemben-

tukan kanker dan terlihat di berbagai

macam jaringan tumor. Metilasi DNA

sendiri digolongkan stabil secara

kimia dan relatif mudah didapat seba-

gai penanda kanker

(1)

. Sumber metilasi

DNA dapat diperoleh dari serum yang

mengandung banyak DNA di samp-

ing dari hasil biopsi jaringan tumor.

Sejumlah sampel biologi yang men-

gandung DNA tumor seperti darah,

cairan tubuh, semen, urin, dan tinja

dari pasien dapat digunakan sebagai

sampel untuk analisis

(6)

Analisis yang dilakukan untuk kanker

prostat, menunjukkan bahwa hiperme-

tilasi 4 panel gen, GSTP1, RAR

, TIG1,

APC ditemukan berkorelasi 100% den-

gan kanker tersebut. Gabungan anali-

sis 4 panel gen di atas dengan anali-

sis histologi memberikan ketepatan

97% untuk deteksi kasus adenocarci-

noma prostat jika dibandingkan den-

gan analisis histologi saja yang hanya

memberikan ketepatan 64%

(6, 11)

Metilasi DNA yang diambil dari sekret

vagina dapat digunakan untuk deteksi

kanker endometrium

(6)

. Deteksi 3 gen,

DAPK1, RAR

, TWIST1 dari sampel

cervical neoplasia memberikan spesi-

fisitas hingga 95% bergantung pada

tahapan tumornya (74% untuk kanker

invasif, dan 52% untuk cervical intra-

ephitelial neoplasia dan carcinoma in

situ

(6, 12)

Hipermetilasi dapat dijumpai pada ta-

hap awal kasus kanker payudara tetapi

tidak dijumpai pada tahap kanker

payudara jinak dan pada payudara nor-

mal. Gen DAPK, APC, dan RASSF1A

ditemukan pada 94 % kasus tumor

payudara dan 76 % berkorelasi dengan

sampel dari DNA serum

(6, 13, 14)

Kasus hipermetilasi berhubungan da-

lam prognosis beberapa penyakit mi-

salnya metilasi E-cadherin berhubun-

gan dengan disease free survival (DFS)

kanker lambung dan carcinoma lidah

nodul positif

(6, 15)

. Protein E-cadherin

berperan dalam perlekatan sel epitel,

hipermetilasi gen ini memacu pada

pembentukan tumor dan resiko me-

tastasis. Hipermetilasi gen ATM yang

berperan untuk perbaikan DNA ber-

korelasi dengan peningkatan radio-

sensitivitas pada cell line tumor col-

orectal

(6)

AGEN DEMETIlASI DNA

Inhibitor metilasi DNA dapat digo-

longkan menjadi tiga golongan be-

sar berdasarkan mekanisme kerjanya

untuk menghambat enzim DNMT

yaitu analogi nukleosida, analogi non

nukleosida, dan antisense oligonuk-

leosida. Analogi nukleosida misalnya

5-Azacytidine, 5-aza-2'-deoxycytidine,

dan Zebularin, sedangkan analogi non

nukleosida seperti Procainamine dan

Procain

(16)

. Golongan analogi nukleo-

sida lebih dulu dikembangkan sehing-

ga lebih banyak diteliti dibandingkan

dengan golongan analogi non nukle-

osida. Mekanisme kerja secara detail

golongan analogi non nukleosida be-

lum banyak diketahui pasti

(17)

Agen demetilasi 5-Azacytidine dan

5-aza-2'-deoxycytidine dalam dosis

rendah tidak menghambat prolif-

erasi sel tetapi mampu menghambat

DNMT. 5-Azacytidine dan 5-aza-2-

'-deoxycytidine telah disetujui peng-

gunaannya oleh FDA untuk pengo-

TINJAUAN

PUSTAKA

CDK ed_177 mei ok.indd 255

4/26/2010 10:53:47 AM

257

| MEI - JUNI 2010

Tabel 1. Gen gen yang umumnya termetilasi pada kanker di manusia dan peranannya dalam pembentukan tumor

(6, 9, 10)

Gen

Peranan dalam Pembentukan Tumor

Jenis Tumor

APC

Proliferasi sel, migrasi sel, reorganisasi sitoskeletal, stabilitas kromosom

yang tidak terkontrol

Payudara

Paru - paru

Esophageal

BRCA1

Gangguan perbaikan DNA dan aktivasi transkripsi

Payudara

Ovarium

CDKN2A/p16

Menghambat proliferasi sel

Gastrointestinal

Kepala dan leher

Non-Hodgkin lymphoma

Paru - paru

DAPK1

Menghambat apoptosis

Paru - paru

E-cadherin

Meningkatkan proliferasi, invasi dan metastasis

Payudara

Tiroid

Lambung

Resistensi untuk estrogen

Payudara

Prostat

GSTP1

Hilangnya kemampuan detoksifikasi metabolit dari bahan - bahan

karsinogen

Prostat

Payudara

Renal

hMLH1

Gangguan perbaikan DNA dan mutasi gen

Kolon

Lambung

Endometrium

Ovarium

MGMT

Gangguan perbaikan DNA dan resistensi obat

Paru - paru

Otak

p15

Proliferasi sel yang tidak terkendali

Leukemia

Lymphoma

Sel karsinoma squamosa paru - paru

RASSF1A

Hilangnya regulator negatif untuk kontrol proliferasi sel melalui fase G1-S

Paru - paru

Ovarium

Ginjal

Nasofaring

Kegagalan menghambat transkripsi gen - gen untuk replikasi DNA dan

pembelahan sel

Retinoblastoma

VHL

Gangguan stabilitas RNA melalui degradasi RNA yang berikatan protein

Renal

Keterangan: APC, adenomatous polyposis coli; BRCA1, breast cancer 1; CDKN2A/p16, cyclin dependent kinase 2A; DAPK1, death associated protein kinase 1; ER,

estrogen receptor; GSTP1, glutathione S-transferase P1; hMLH1, Mut L homologue 1; MGMT, O-6 methylguanine-DNA methyltransferase; RASSF1A, Ras association

domain family member 1; Rb,retinoblastoma; VHL, von Hippel-Lindau.

TINJAUAN

PUSTAKA

CDK ed_177 mei ok.indd 257

4/26/2010 10:55:02 AM

258

| MEI - JUNI 2010

serta hanya mempengaruhi rata-rata

6 macam gen dari 13.300 gen yang

terdemetilasi dibandingkan pada sel

fibroblast normal

(20)

DAFTAR PUSTAKA

1. Herman J, Baylin S. Gene silencing in cancer in

association with promoter hypermethylation.

N Engl J Med 2003;.349: 2042-2054.

2. Baylin S. DNA methylation and gene silencing

in cancer. Nat Clin Pract Oncol., 2005; 2: S4-

11,

3. Yang X, Yan L, Davidson N. DNA methylation

in breast cancer. Endocr Relat Cancer 2001; 8:

115-127,

4. Fiegl H, Millinger S, Goebel G, Muller-Holzner

E, Marth C, Laird PW, Widschwendter M.

Breast Cancer DNA Methylation Profiles in

Cancer Cells and Tumor Stroma: Association

with HER-2/neu Status in Primary Breast Can-

cer. Cancer Res. 2006; 66: 29-33,

5. Krueger KE, Srivastava S. Posttranslational

Protein Modifications: Current Implications for

Cancer Detection, Prevention, and Therapeu-

tics. Mol Cell Proteomics 2006;5: 1799-1810,

6. Paluszczak J, Baer-Dubowska W. Epigenetic

diagnostics of cancer--the application of DNA

methylation markers. J Appl Genet2006; 47:

365-375,

7. Luczak M, Jagodzinski P. The role of DNA

methylation in cancer development. Folia His-

tochem Cytobiol 2006; 44: 143-154,

8. Gilbert J, Gore S D, Herman JG, Carducci MA.

The Clinical Application of Targeting Cancer

through Histone Acetylation and Hypomethy-

lation. Clin Cancer Res 2004;10: 4589-4596.

9. Das PM, Singal R. DNA Methylation and Can-

cer. J Clin Oncol 2004; 22: 4632-4642,

10. Robertson K. DNA methylation, methyltrans-

ferases, and cancer. Oncogene 2001;20: 3139-

3155,

11. Tokumaru Y, Harden SV, Sun D.-I, Yamashita

K, Epstein JI, Sidransky D. Optimal Use of a

Panel of Methylation Markers with GSTP1 Hy-

permethylation in the Diagnosis of Prostate

Adenocarcinoma. Clin Cancer Res.2004;10:

5518-5522,

12. Feng Q, Balasubramanian A, Hawes SE, Toure

P, Sow PS, Dem A, Dembele B, Critchlow CW,

X, L, Lu H, McIntosh MW, Young AM, Kiviat

NB. Detection of Hypermethylated Genes in

Women with and Without Cervical Neoplasia.

J. Natl. Cancer Inst., 2005; 97: 273-282,

13. Dulaimi E, Hillinck J, de Caceres II, Al-Saleem

T, Cairns P. Tumor Suppressor Gene Promoter

Hypermethylation in Serum of Breast Cancer

Patients. Clin Cancer Res. 2004;10: 6189-6193

14. Hoque MO, Feng Q, Toure P, Dem A, Critch-

low CW, Hawes SE, Wood T, Jeronimo C,

Rosenbaum E, Stern J, Yu M, Trink B, Kiviat NB,

Sidransky D. Detection of Aberrant Methyla-

tion of Four Genes in Plasma DNA for the De-

tection of Breast Cancer. J Clin Oncol. 2006;24:

4262-4269,

15. Waki T, Tamura G, Tsuchiya T, Sato K, Nishi-

zuka S, Motoyama T. Promoter Methylation

Status of E-Cadherin, hMLH1, and p16 Genes

in Nonneoplastic Gastric Epithelia. Am J

Pathol.2002;161: 399-403.

16. Peedicayil J. Epigenetic therapy--a new devel-

opment in pharmacology. Indian J Med Res.,

2006;123: 17-24,

17. Issa J.-P. J. DNA Methylation as a Therapeu-

tic Target in Cancer. Clin Cancer Res. 2007;13:

1634-1637,

18. Dowell JE, Minna JD. Cancer Chemotherapy

Targeted at Reactivating the Expression of

Epigenetically Inactivated Genes. J Clin On-

col.2004; 22: 1353-1355,

19. Yoo CB, Cheng JC, Jones PA. Zebularine: a

new drug for epigenetic therapy. Biochem.

Soc. Trans.2004; 32: 910-912,

20. Cheng JC, Yoo CB, Weisenberger DJ, Chuang,

J, Wozniak C, Liang G, Marquez VE, Greer S.

Orntoft TF, Thykjaer T, Jones PA. Preferential

response of cancer cells to zebularine. Cancer

Cell 2004; 6: 151-158

batan neoplasma (myelodysplastic

syndrome). Limitasi dari analog nukle-

osida ini adalah memerlukan inkorpo-

rasi DNA dan sintesis DNA aktif, jadi

terbatas pada sel yang hipo-proliferasi

(termasuk yang berpotensial sebagai

cancer stem cell)

(17)

, tidak stabil dalam

bentuk larutan dan harus diberikan

secara parenteral atau subkutan, serta

berefek samping myelosupresi

(1)

, atau

menimbulkan efek hipometilasi pada

beberapa gen pertumbuhan

(18)

. Secara

in vitro obat di atas terbukti mampu

mengurangi aktivitas DNMT1, DN-

MT3A dan DNMT3B pada konsentrasi

mikromolar dan menginduksi deme-

tilasi dari CDKN2A, RB1, MLH1, dan

tumor suppressor gene lainnya pada

sel kanker. 5-Azacytidine akan difos-

forilasi oleh uridin-sitidin nukleotida

kinase menjadi 5-Azacytidine difosfat

yang dapat direduksi oleh ribonukle-

otida reduktase menjadi 5-aza-deoxy-

cytidine difosfat yang akan inkorporasi

dengan DNA. 5-aza-deoxycytidine

nukleosida dari DNA membentuk ika-

tan kovalen dengan DNMT sehingga

terjadi inaktivasi enzim ini. Perlakuan

5-aza-deoxycytidine pada HCT116 sel

kanker kolon manusia menunjukkan

adanya penurunan aktivitas DNMT1

sehingga menginduksi ekspresi MLH1

dan menyebabkan penghentian per-

tumbuhan sel

(7)

Zebularine merupakan alternatif ked-

ua setelah 5-Azacytidine dan 5-aza-

2'-deoxycytidine

(19)

. Obat ini relatif

lebih stabil dan memiliki waktu paruh

kurang lebih 44 jam pada 37°C di PBS

pada pH 1.0 dan kurang lebih 508 jam

pada pH 7.0 sehingga memungkinkan

untuk dibuat sediaan oral. Penelitian

menunjukkan pemberian obat ini se-

cara oral pada nude mice yang ditrans-

plan dengan sel tumor manusia dapat

menyebabkan demetilasi dan reakti-

vasi gen p16. Zebularine juga memi-

liki efek sitotoksik yang lebih rendah

baik secara

in vitro maupun in vivo.

Pemberian Zebularine sebagai terapi

lanjutan setelah 5-aza-deoxycytidine

dapat mencegah terjadinya remeti-

lasi DNA

(19)

. Perlakuan Zebularine in

vitro pada sel kanker T24, HCT-15,

CFPAC-1, SW48, dan HT-29 menunjuk-

kan adanya penurunan level DNMT,

TINJAUAN

PUSTAKA

CDK ed_177 mei ok.indd 258

4/26/2010 10:55:02 AM