hasil penelitian

cdk 161/vol.35 no.2 Mar-Apr 2008

Ekspansi

Endothelial Progenitor Cell

Gsjtdb-!!Dbspmjof!U/!Tbsekpop-!!Gfssz!Tboesb

Tufn!Dfmm!Ejwjtjpo-!!Tufn!Dfmm!boe!Dbodfs!Jotujuvuf-!!Lbmcf!Qibsnbdfvujdbm!Dpnqboz!Kblbsub-!!Joepoftjb

QFOEBIVMVBO

Kerusakan atau disfungsi sel endotel merupakan sti-

mulus utama untuk terjadinya arterosklerosis

. Hal ini

menyebabkan terjadinya gangguan aliran darah yang

dapat berakibat fatal seperti ditemukan pada penyakit

distrofi muskular, gagal ginjal akut (CRF), dan

stroke

Tidak hanya itu, arterosklerosis pada pembuluh darah

jantung (kardiovaskular) menyebabkan

infark miokard

akut yang juga termasuk dalam daftar penyakit utama

penyebab kematian di dunia.

Ditemukannya

Endothelial Progenitor Cell

(EPC) mem-

bawa implikasi besar dalam dunia ilmiah dan kedok-

teran.

EPC

dapat memediasi terjadinya pembentukan

pembuluh darah baru (neovaskularisasi dan angioge-

nesis) dan menjaga integritas pembuluh darah

. De-

ngan demikian transplantasi

EPC

menjadi suatu alter-

natif terapi untuk mengatasi penyakit akibat gangguan

pembuluh darah

EPC dapat diisolasi dari berbagai sumber, antara lain

darah tali pusat

1,5,6

, darah tepi

1,3,7

, sumsum tulang

1,8,9

dan juga pada jaringan tubuh lainnya, seperti jari-

ngan lemak, hati, jantung, limpa, dan saluran pencer-

naan

10,11

. Namun, jumlah

EPC

yang sangat terbatas

dari berbagai sumber tersebut membatasi penggu-

naan

EPC

sebagai terapi. Oleh karena itu, diperlukan

upaya untuk memperbanyak

EPC

dengan cara meng-

kultur secara

in vitro

(ekspansi) untuk memenuhi jum-

lah kebutuhan dalam terapi.

Lbsblufsjtujl!ebo!qfsbo!FQD

EPC

merupakan sel yang memiliki karakteristik seperti

sel

punca

(

stem cell

), namun memiliki kemampuan prolif-

BCTUSBL

Ditemukannya

EPC

membawa pengaruh yang besar dalam terapi penyakit pembuluh darah. Keterbatasan jum-

lah

EPC

dalam sirkulasi darah menjadi hambatan utama dalam pengembangan

EPC

sebagai produk terapi sel.

Berbagai upaya telah dilakukan dalam meningkatkan jumlah

EPC

dengan cara mengkultur secara

in vitro

untuk

mendapatkan jumlah

EPC

yang dibutuhkan. Dalam artikel ini, akan diuraikan mengenai karakteristik, berbagai

upaya ekspansi EPC dan metode yang sekarang ini digunakan untuk mengidentifikasi dan menghitung

EPC

Kata kunci : EPC, sel punca, ekspansi, identifikasi, Endothelial Progenitor Cell.

erasi dan diferensiasi yang lebih terbatas. Sel ini bersifat

unipoten, yaitu dapat berdiferensiasi menjadi sel endotel

matang.

EPC

memiliki peran penting dalam pembentu-

kan pembuluh darah dan remodelisasi sel endotelial pada

pembuluh darah yang mengalami kerusakan

12-15

EPC

didefinisikan sebagai bagian dari sel berinti tung-

gal (

mononucelar cell

atau

MNC

) yang memiliki molekul

penanda sel punca hematopoietik, yaitu CD34, suatu

glikoprotein yang memediasi pelekatan sel punca pada

matriks ekstraseluler sumsum tulang dan CD133,

suatu glikoprotein yang dilaporkan merupakan molekul

penanda untuk sel punca yang lebih primitif dibanding-

kan CD34, sampai saat ini fungsi dari molekul CD 133

masih belum diketahui dengan pasti

EPC

yang telah

mengalami diferensiasi menjadi sel yang lebih matang

secara berangsur-angsur akan kehilangan ekspresi

CD34.

EPC

juga dilaporkan memiliki molekul penanda

sel endotelial, yaitu KDR (

Kinase Insert Domain Re-

ceptor

), suatu protein yang berperan penting dalam

menstimulasi proliferasi, perkembangan pembuluh

darah baru (

sprouting

), dan angiogenesis.

EPC

juga

berperan dalam pelekatan dan interaksi antar sel

17,18

Beberapa molekul penanda sel endotelial matang lain-

nya yang dapat dimiliki oleh

EPC

antara lain sebagai

berikut: CD31 (

Platelet endothelial cell adhesion mol-

ecule-1

), berperan dalam pelekatan sel endotel dan

merupakan molekul yang berperan dalam proses mi-

grasi leukosit melalui jaringan interseluler sel-sel en-

dotel; CD146 (P1H12), berperan dalam memediasi

pelekatan antar sel endotel

19,20

;

Von Willebrand factor

(vWF), berperan dalam proses koagulasi darah; Tie-2

berperan dalam pematangan jaringan sel endotel se-

Hasil Penelitian

cdk 161/vol.35 no.2 Mar-Apr 2008

lama

vaskulogenesis

atau

angiogenesis

; dan

Endothe-

lial nitric oxide synthase

(NOS), berperan dalam pen-

gaturan fungsi pembuluh darah

EPC

dapat berperan dalam proses yang bersifat fisio-

logis maupun patologis. Dalam proses yang bersifat

fisiologis,

EPC

merupakan sel progenitor yang memi-

liki kemampuan untuk membelah dan berdiferensiasi

menjadi sel endotelial matang

. Dengan demikian

EPC

ikut menjaga integritas pembuluh darah melalui

fungsinya dalam menggantikan sel-sel endotel yang

rusak (reendotelialisasi) dan pembentukan pembuluh

darah baru

21,22

. Dalam proses yang bersifat patologis,

EPC turut berperan dalam angiogenesis pada penyakit

tumor sehingga dapat menyebabkan semakin cepat-

nya pertumbuhan tumor

Vqbzb!fltqbotj!

FQD

Seperti telah dikemukakan sebelumnya, bahwa

EPC

dapat diisolasi dari berbagai sumber, dengan jumlah

EPCs

<1% dalam jumlah total sel mononuklear pada

sumsum tulang dan < 0.01% dalam peredaran darah

perifer

. Sedangkan jumlah

EPC

yang dibutuhkan un-

tuk digunakan dalam terapi manusia dewasa cukup

besar jumlahnya. Dilaporkan bahwa diperlukan kurang

lebih 3x108 sampai 6x108 sel yang berarti dibutuh-

kan 8,5-120 liter darah perifer untuk memperoleh

EPC

dalam jumlah cukup

15,23

Untuk mengatasi keterbatasan tersebut, maka banyak

penelitian telah dilaksanakan dalam upaya mengeks-

pansi jumlah

EPC

. Penelitian akhir-akhir ini mengemu-

kakan beberapa proses penting yang menjadi kom-

ponen utama dalam metode ekspansi jumlah

EPC

Proses tersebut dimulai dengan proses isolasi

EPC

proses kultur dengan menggunakan beberapa jenis

media, dan proses penentuan jumlah

EPC

yang ber-

hasil dikumpulkan. Masing-masing proses di atas akan

diuraikan secara singkat sebagai berikut.

Jtpmbtj!

FQD

Berbagai metode isolasi sel yang akan diekspansi di

antaranya yaitu metode isolasi sel berdasarkan karak-

teristik inti selnya dan molekul penanda yang terletak

pada permukaan sel.

Metode isolasi sel yang paling sederhana adalah de-ngan

menggunakan metode sentrifugasi untuk memisahkan

fraksi sel berinti tunggal (MNC) dari sel-sel lain di dalam

darah. Sel yang disentrifugasi dalam suatu gradien den-

gan massa tertentu akan dapat dipisahkan berdasar-

kan densitasnya. Metode ini akan memisahkan sel yang

densitasnya lebih tinggi seperti sel darah merah dan sel

granulosit dengan sel yang densitasnya lebih rendah sep-

erti MNC, di dalamnya termasuk sel punca, progenitor,

limfosit, dan monosit. Salah satu reagen yang sering di-

gunakan dalam metode ini adalah

Ficoll

Metode isolasi lainnya adalah berdasarkan molekul

penanda pada permukaan sel yang bertujuan untuk

mendapatkan fraksi sel yang lebih spesifik dibanding-

kan metode sentrifugasi. Prinsip dari metode ini antara

lain melalui reaksi pemisahan berdasarkan kompleks

antara antigen dan antibodi. Antigen yang digunakan

dalam metode ini adalah molekul penanda permukaan

sel yang akan diisolasi, dan antibodi spesifik terhadap

antigen yang digunakan berada dalam keadaan teri-

kat dengan

magnetik microbeads

. Pemisahan dilaku-

kan dalam medan magnet, oleh karena itu metode ini

disebut separasi imunomagnetik. Untuk metode ini,

diperlukan beberapa perangkat instrumen tambahan

seperti

magnetik microbeads

beserta perangkat un-

tuk separasi, antara lain kolom dan separator. Kolom

disisipkan di antara separator, yang merupakan me-

dan magnet kuat, sehingga sel dengan antigen terten-

tu yang sudah diikat oleh antibodi pada microbeads

akan tertahan di kolom dan dapat dipisahkan untuk

digunakan lebih lanjut. Proses ini dapat digunakan un-

tuk mendapatkan fraksi sel yang memiliki molekul pe-

nanda tertentu (seleksi positif) atau sebaliknya (seleksi

negatif). Aplikasi penggunaan separasi imunomagnetik

dalam pengisolasian kandidat sel EPC yang sudah di-

lakukan antara lain untuk mendapatkan fraksi sel yang

memiliki molekul penanda CD14, CD34, CD133, atau

CD146 untuk digunakan dalam proses selanjutnya

Berbagai metode isolasi dan fraksi sel yang dihasilkan be-

serta sumber pustakanya dapat dilihat pada ubcfm!2.

Ubcfm!2!!Nfupef!jtpmbtj!ebo!gsbltj!tfm!zboh!ejibtjmlbo!vouvl!fltqbotj!

FQD

Lvmuvs0!Fltqbotj!

FQD

Dalam upaya ekspansi jumlah

EPC

secara

in vitro

pada umumnya digunakan media basal beserta kom-

binasi bahan tambahan yang ditujukan untuk mening-

katkan proliferasi sel dan diferensiasinya menjadi

EPC

Media basal yang umum digunakan antara lain

Endo-

Metode

Sentrifugasi

(densitas-gradien)

Separasi imunomagnetik

Fraksi sel

MNC

CD14

CD34

CD133

CD146

Sumber pustaka

24-28

16,18,30

21,31

cdk 161/vol.35 no.2 Mar-Apr 2008

menyerupai pembuluh darah secara

in vitro

Bermacam-macamnya pendefinisian

EPC

(Tabel 2)

menyebabkan bervariasinya jumlah

EPC

yang diperoleh

dari studi-studi yang telah dilakukan. Berdasarkan mor-

fologinya, jumlah

EPC

pada 1 ml darah manusia dewasa

segar adalah 1,6x10

sampai 3x10

sel

31,34

. Sedangkan

berdasarkan fenotipenya (CD133+/KDR+), dilaporkan

jumlah EPC pada peredaran darah tepi dewasa normal

yaitu sekitar 0,002% dari total sel mononuklear atau

rata-rata 66 sel/ml17. Oleh karena itu standarisasi

dalam pendefinisian EPC sangat diperlukan.

Uboubohbo!ebmbn!fltqbotj!FQD

Hingga saat ini, upaya ekspansi

EPC

masih dipersulit

dengan adanya berbagai tantangan. Tantangan terse-

but di antaranya adalah mencari pengganti komponen

hewan dalam komposisi media kultur untuk mengeks-

pansi

EPC

. Komponen hewan dalam media kultur, di-

mana belum teridentifikasi dengan jelas komposisinya,

berpotensi sebagai pembawa agen/mikroorganisme

patogen, menimbulkan reaksi penolakan imun pada re-

sipien, serta juga dapat menyebabkan hasil kultur ber-

variasi pada setiap

batchnya

. Oleh karena itu, upaya

ekspansi

EPC

dengan tidak menggunakan komponen

dari spesies berbeda (

xeno free

) sangat diperlukan.

Tantangan lainnya dalam ekspansi adalah dapat menghasil-

kan

EPC

dalam jumlah besar sehingga dapat mencu-

kupi kebutuhan dalam terapi. Sehubungan dengan hal

ini, berbagai studi sudah dilakukan dan masih terus

dikembangkan untuk meningkatkan upaya ekspansi

EPC

yang sudah ada. Di antaranya adalah dengan

rekayasa genetik, yaitu transfer gen

human telom-

erase reverse transcriptase

(hTERT)

35,36

atau gen

penyandi faktor proangiogenesis seperti

vascular

endothelial growth factor

(VEGF) ke dalam

EPC

Tantangan lain yang tidak kalah pentingnya adalah

perlu ditentukannya karakteristik, baik morfologi,

fenotipe, atau batasan fungsional yang paling te-

pat dalam mendefinisikan EPC.

thelial Basal Medium-2

(EBM-2), M-199, dan

Iscove's

Modified Dulbecco's Medium

(IMDM)

1,7,8

. Komposisi

campuran medium tiap studi berbeda-beda. Media

basal tersebut umumnya ditambahi serum untuk

mendukung pertumbuhan sel dan antibiotik untuk

menghindari tumbuhnya kontaminasi

. Selain itu, me-

dia basal juga seringkali ditambah dengan berbagai

suplemen, seperti

bovine pituitary extract

atau

bovine

brain extract

, atau faktor-faktor pertumbuhan untuk

membantu pertumbuhan dan diferensiasi menjadi sel

endotelium, seperti

Vascular Endothelial Growth Fac-

tor

(VEGF),

basic Fibroblast Growth Factor

(b-FGF),

Epidermal Growth Factor

(EGF), dan

Insulinlike Growth

Factor -1

(IGF-1)

Qfofouvbo!kvnmbi!

FQD

Dilakukannya penentuan jumlah

EPC

pada peredaran da-

rah tepi manusia dapat memberikan informasi yang pen-

ting dalam keberhasilan pengkulturan

EPC

. Ditambah lagi,

jumlah

EPC

dapat digunakan sebagai penanda (

marker

)

biologi untuk mengevaluasi fungsi pembuluh darah

. teta-

pi metode penghitungan

EPC

yang telah digunakan pada

banyak studi menghasilkan variabilitas pada jumlah

EPC

yang telah dilaporkan, mengingat belum adanya definisi

tunggal di antara para peneliti untuk

EPC

. Beberapa stu-

di melaporkan beberapa variasi dalam definisi

EPC

yang

juga dipakai sebagai acuan dalam penghitungan jumlah

EPC

a. Berdasarkan morfologi

Sel berbentuk

spindle

dan membentuk koloni bulat

atau sel berbentuk

cobblestone

didefinisikan se-

bagai

EPC

b. Berdasarkan fenotipe, yaitu antigen permukaan sel.

Pada keba-nyakan studi,

EPC

diidentifikasi dan di-

hitung melalui

flowcytometry

, yaitu dengan identifi-

kasi sel-sel yang memiliki molekul penanda sel he-

matopoietik dan sel endotel, yaitu CD34, CD133,

dan KDR

9,12,22

c. Berdasarkan karakteristik fungsional

EPC

dapat dikarakterisasi secara fungsional melalui

beberapa metode, antara lain pengikatan dengan

lektin, kemampuan endositosis senyawa lipopro-

tein, atau kemampuan untuk membentuk struktur

Gambar 1 Sel berbentuk

spindle dengan koloni berbentuk bulat

dalam kultur

in vitro pada hari ke 5 (Kiri). Sel berbentuk cobble-

stone dalam kultur in vitro pada hari ke 19 (Kanan)

Kedua morfologi sel tersebut diklaim sebagai EPC

28,30

Jenis Analisa

Morfologi

Fenotipe

Fungsional

Keterangan

Sel berbentuk spindle

dengan koloni berbentuk bulat

(Gambar 1 kiri)

Sel berbentuk cobblestone

(Gambar 1 kanan)

CD146+

CD34+/CD45+

CD34+/VEGFR-2+ atau

CD133+/VEGFR-2+

Pengikatan dengan lektin dan

endositosis lipoprotein

Sumber pustaka

21,27,28

25,29,30

8,17,24

3,7

Ubcfm!3!!Nbdbn!kfojt!qfoefgjojtjbo!vouvl!qfohijuvohbo!FQD

cdk 161/vol.35 no.2 Mar-Apr 2008

LFQVTUBLBBO

1. Hill J, Zalos G, Halcox JPJ, dkk. Circulating Endothelial Progenitor

Cells, Vascular Function, and Cardiovascular Risk. N Engl J Med.

2003;348;593-600

2. Choi JH, Kim KL, Huh W, dkk. Decreased number and impaired angio-

genic function of endothelial progenitor cells in patients with chronic

renal failure. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24;1246 52.

3. Asahara T, Murohara T, Sullivan A, dkk. Isolation of Putative Progeni-

tor Endothelial Cells for Angiogenesis. Science. 1997;275;964-7.

4. Franz WM, Zaruba M, Theiss H, dkk. Stem-cell homing and tissue re-

generation in ischaemic cardiomyopathy. Lancet. 2003;362;675-6.

5. Murohara T, Ikeda H, Duan J, dkk. Transplated cord blood-derived

endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. J

Clin Invest. 2000; 105;1527-36.

6. Ingram DA, Mead LE, Tanaka H, dkk. Identification of a novel hierarchy

of endothelial progenitor cells utilizing human peripheral and umbilical

cord blood. Blood. 2004-04-1396.

7. Gulati R, Jevremovic D, Peterson TE, dkk. Diverse origin and function

of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood.

Circ Res. 2006; 93;1023-5.

8. Lin Y, Weisdorf DJ, Solovey A, dkk. Origin of circulating endothelial cells

and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 2000;105;71-7.

9. Yoder MC, Mead LE, Prater D, dkk. Re-defining endothelial progeni-

tor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cells

principals. Blood. 2007;109;1801-9.

10. Urbich C, Dimmeler S. Endothelial Progenitor cells. Characterization

and role in vascular biology. Circ Res. 2004;95;343-53.

11. Doyle B, Metharom P, Caplice NM. Endothelial Progenitor Cells. Endo-

thelium. 2006;13;40310.

12. Lutun A, Verfaillie CM. Will the real EPC please stand up? Blood.

2007;109;1795-6.

13. Khakoo AY, Finkel T. Endothelial Progenitor Cells. Annu Rev Med.

2005;56;79-101.

14. Ribatti D. The discovery of endothelial progenitor cells An historical

review. Leukem Res. 2006;31:439-44.

15. Smadja DM, Cornet A, Emmerich J, dkk. Endothelial progenitor cells:

Characterization, in vitro expansion, and prospects for autologous cell

therapy. Cell Biol Toxicol. 2007;23: 22339.

16. Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D, dkk. Expression of VEGFR-2 and

AC133 by circulating human CD341 cells identifies a population of

functional endothelial precursors. Blood. 2000;95;952-8.

17. Sills AD, Blunden MJ, Mawdsley J, dkk. New flow cytometic technique

for the evaluation of circulating endothelial progenitor cell levels in

various disease groups. J Immuno Methods. 2006;316:107-15.

18. Bompais H, Chagraoui J, Canron X, dkk. Human endothelial cells

derived from circulating progenitor display specific functional prop-

erties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood.

2004;103;2577-2584.

19. George DF, Sabatier F, Blann A. Detection of Circulating Endothelial

Cells : CD146-based Magnetic Separation Enrichment or Flowcyto-

metric Assay? J of Clin Onco. 2007;25;e1-e2.

20. Woywodt A, Kirsch T, Haubitz M. Immunomagnetic isolation and FACS-

competing techniques for the enumeration of circulating endothelial

cells. Thromb Haemost. 2006;96;1-2.

21. Rustemeyer P, Wittkowski W, Greve B, dkk. Flow-cytometric Iden-

tification, Enumeration, Purification, and Expansion of CD133+ and

VEGF-R2+ Endothelial Progenitor Cells from Pheripheral Blood. J Im-

munoassay & Immunochemistry. 2007;28;13-23.

22. Fuchs S, Hermanns MI, Kirkpatrick CJ. Retention of a differentiated

endothelial phenotype by outgrowth endothelial cells isolated from hu-

man peripheral blood and expanded in long-term cultures. Cell Tissue

Res. 2006;326;7992.

23. Kawamoto A, Gwon HC, Tkebuchava T, dkk. Intramyocardial transplan-

tation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neo-

vascularization of myocardial ischemia. Circulation. 2003;107;461-

24. Assmus B, Schachinger V, Teupe C, dkk. Transplantation of Progeni-

tor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarc-

tion (TOPCARE-AMI). Circulation. 2002;106;300917.

25. Hur J, Yoon CH, Kim HS, dkk. Characterization of two types of endo-

thelial progenitor cells and their different contributions to neovasculo-

genesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24;288-93.

26. Aoki M, Yasutake M, Murohara T. Derivation of Functional Endothelial

Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood Mononuclear Cells

Isolated by a Novel Cell Filtration Device. Stem Cell. 2004;22;994-

1002.

27. Kalka C, Masuda H, Takahashi T, dkk. Transplantation of ex vivo ex-

panded endothelial progenitor cells for therapeutic neovasculariza-

tion. PNAS. 2000;97;3422-7.

28. Holgado NL, Alberca M, Guijo FS, dkk. Short-term endothelial progeni-

tor cell colonies are composed of monocytes and do not acquire en-

dothelial markers. Cytotherapy. 2007;9;14- 22.

29. Yoon CH, Hur J, Park KW, dkk. Synergistic Neovascularization by

Mixed Transplantation of early Endothelial Progenitor Cells and Late

Outgrowth Endothelial Cells: The Role of Angiogenic Cytokines and

Matrix Metalloproteinases. Circulation. 2005;112;1618-27.

30. Timmermans F, Hauwermeiren FV, Smedt MD, dkk. Endothelial Out-

growth Cells Are Not Derived From CD133+ Cells or CD45+ He-

matopoietic Precursors. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007;

10.1161/ATVBAHA.107.144972.

31. Gehling UM, Ergu¨n SL, Schumacher U, dkk. In vitro differentiation

of endothelial cells from AC133-positive progenitor cells. Blood.

2000;95;3106-12.

32. Delorme B, Basire A, Gentile C, dkk. Presence of endothelial pro-

genitor cells, distinct from mature endothelial cells, within human

CD146+ blood cells. Thromb Haemost. 2005;94:1270-9.

33. Lenk K, Adams V, Lurz P, dkk. Therapeutical potential of blood-derived

progenitor cells in patients with peripheral arterial occlusive disease

and critical limb ischemia. European heart. 2005;26;1903-9.

34. Sharpe EE, Teleron AA, Li B, dkk. The origin and in vivo significance of

Murine and Human culture expanded endothelial progenitor cells. Am

J. Path. 2006;168;1710-21.

35. Smadja DM, Che IB, Emmerich J, dkk. PAR-1 activation has differ-

ent effects on the angiogenic activity of endothelial progenitor cells

derived from human adult and cord blood. J Thromb Haemost.

2006;4;20518.

36. Murasawa S, Llevadot J, Silver M, dkk. Constitutive human telomerase

reverse transcriptase expression enhances regenerative properties

of endothelial progenitor cells. Circulation. 2002;106;1133-9.