hasil penelitian

cdk 161/vol.35 no.2 Mar-Apr 2008

Hasil Penelitian

Bmufsfe!Ovdmfbs!Usbotgfs

;!Qfohfncbohbo!Uflojl!

Tpnbujd!Dfmm!Ovdmfbs!Usbotgfs

!vouvl

Nfohbubtj!Nbtbmbi!Fujlb

Ibssz!Nvsuj

2-3

-!!Nplibnbe!Gbisvejo

-!!Dbspmjof!Ubo!Tbsekpop

-!!Cpfokbnjo!Tfujbxbo

-!!Gfssz!Tboesb

!Tufn!Dfmm!Ejwjtjpo-!!Tufn!Dfmm!boe!Dbodfs!Jotujuvuf-!!Lbmcf!Qibsnbdfvujdbm!Dpnqboz!Kblbsub-!!Joepoftjb

Mbcpsbupsz!pg!Fncszpmphz-!!Gbdvmuz!pg!Wfufsjobsz!Nfejdjof-!!Cphps!Bhsjdvmuvsbm!Vojwfstjuz-!!Cphps-!!Joepoftjb/

BCTUSBL

Embrio hasil SCNT dapat dijadikan sebagai sumber

Embryonic Stem Cell

(ESC) yang bersifat pluripoten dan meru-

pakan

patient-specific stem cells

. Penerapan teknik SCNT bertujuan untuk aplikasi konsep

therapeutic cloning

dan

regenerative medicine

melalui teknik transplantasi autologous, sehingga tidak menimbulkan reaksi penolakan ja-

ringan pada tubuh pasien. Terobosan baru dalam teknik ini adalah menghambat pembentukan trofektoderm pada

embrio hasil SCNT, sehingga embrio hanya akan membentuk

Inner Cell Mass

(ICM) dan tidak dapat berimplantasi

ke dalam jaringan endometrium. Pengembangan teknik yang dikenal dengan

Altered Nuclear Transfer

(ANT) di-

harapkan mampu menjadi solusi bagi permasalahan etika penggunaan embrio sebagai sumber ESC. Metode ANT

dengan menggunakan

RNA interference

(RN Ai) untuk mencegah ekspresi gen Cd x2 pada embrio hasil SCNT

akan dibahas dalam artikel ini.

Kata Kunci: ANT, SCNT, Trofektoderm, RN Ai, Cd x2

QFOEBIVMVBO

Perkembangan teknik

Somatic Cell Nuclear Transfer

(SCNT) telah menjadi alternatif baru dalam kemajuan

riset biomedis

. Aplikasi teknik SCNT dapat digunakan

untuk untuk memproduksi

Embryonic Stem Cell

(ESC)

Secara garis besar teknik transfer inti sel somatik

(SCNT) meliputi 3 langkah utama (Gambar 1), yakni:

(1) enukleasi atau pembuangan inti oosit yang akan digu-

nakan sebagai resipien sitoplasma (oosit resipien),

(2) transfer inti atau pemasukan inti sel somatik ke

dalam oosit resipien,

(3) aktivasi atau induksi oosit hasil rekonstruksi agar dapat

berkembang menjadi embrio yang kemudian dikenal se-

bagai embrio SCNT yang dapat dijadikan sebagai sum-

ber sel punca

Sel lestari (

cell line

) ESC yang

dihasilkan melalui teknik

SCNT sering disebut dengan

istilah ntESC (

nuclear trans-

fer Embryonic Stem Cell

)

Sel lestari ntESC diperoleh

dari kultur sel embrio hasil

aplikasi SCNT hingga men-

capai tahap blastosis, lalu

bagian

Inner Cell Mass

(ICM)

diisolasi dan dikultur dengan

medium spesifik

. Teknik

isolasi ICM dapat dilakukan

baik secara mekanik de-

Gambar 1. Skema teknik SCNT pada mencit. 1: enukleasi atau

pembuangan inti oosit yang akan digunakan sebagai oosit resipien; 2:

transfer inti atau pemasukan inti sel somatik ke dalam oosit resipien;

3: aktivasi atau induksi oosit hasil rekonstruksi agar dapat berkem-

bang menjadi embrio.

ngan menggunakan mikromanipulator ataupun secara

enzimatik dengan menggunakan reaksi antigen-antibodi

yang secara spesifik melisis sel-sel trofoblas

Medium spesifik untuk kultur ICM agar dapat berprolife-

rasi dan juga mempertahankan sifat pluripotensi serta

karakter sel punca yang dimiliki

. Pada ntESC mencit,

penambahan

Leukemia Inhibitory Factor

(LIF) berfungsi

untuk mempertahankan keadaan tidak berdiferensiasi

(

undifferentiated stage

)

. Sedangkan pada manusia, peng-

gunaan

Mouse Embryonic Fibroblast

(MEF) sebagai feeder

layer dapat mencegah proses differensiasi

. Hasil kultur

ntESC dapat dimanfaatkan sebagai sumber ESC yang apa-

bila diperlukan dapat diinduksi

untuk berdiferensiasi menjadi

tipe-tipe sel tertentu

10,11

. Sel-

sel hasil diferensiasi tersebut

dapat digunakan untuk tujuan

terapi berbasis sel pada ber-

bagai jenis penyakit degenera-

tif

. Beberapa penelitian ter-

dahulu menunjukkan bahwa

ESC dapat diarahkan menjadi

sel-sel neuron

13,14

, ginjal

otot jantung

16,17

, pankreas

Secara teoritis, ntESC memi-

liki kelebihan dibandingkan

dengan sumber ESC lainnya,

cdk 161/vol.35 no.2 Mar-Apr 2008

endometrium

. Dilapor-

kan bahwa, pada embrio

mencit gen yang bertang-

gung jawab terhadap pem-

bentukan trofektoderm

adalah Cdx2, yang apabila

ekspresinya dihambat akan

menyebabkan trofektoderm

tidak terbentuk sehingga

embrio tidak dapat melaku-

kan proses implantasi

Informasi ini juga didukung

dengan hasil penelitian bah-

wa gen Cdx2 secara

in vitro

dapat menginduksi diferen-

siasi ESC mencit menjadi

sel-sel trofoblas

. Diferensiasi

menjadi sel-sel trofoblas juga

dapat dipengaruhi oleh interak-

si antara Oct

dengan Cdx2

Telah dilaporkan bahwa pada

embrio mencit ekspresi gen

Cdx2 dapat dihambat dengan

menggunakan RNAi sehingga

tidak dapat membentuk trofek-

toderm (Gambar 2). Namun

demikian dari embrio ini ma-

sih dapat diperoleh sel-sel ICM

yang dapat diturunkan menjadi

sel punca pluripoten yang mam-

pu berintegrasi pada hewan chimera

. Walaupun teknik

ANT telah berhasil diaplikasikan pada embrio mencit, na-

mun masih harus dibuktikan pada embrio manusia

UFLOJL! EBO! NFLBOJTNF! QFOHIBNCBUBO!

FLTQSFTJ!Dey3!QBEB!FNCSJP!IBTJM!TDOU

Secara teoritis, penghambatan ekspresi Cdx2 dapat

dilakukan dengan berbagai macam cara di antaranya

adalah dengan menggunakan

antisense

DNA

, Ribozymes

dan RNAi. Prinsip kerja

antisense

DNA adalah berikatan

dengan mRNA yang merupakan komplemennya, sehing-

ga proses translasi tidak terjadi. Sedangkan enzim Ribo-

zymes dapat digunakan untuk memotong mRNA spe-

sifik menjadi potongan kecil-kecil sehingga mRNA tidak

dapat berfungsi normal

. Cara lain untuk menghambat

ekspresi gen adalah dengan menggunakan sistem RNA

interference

(RNAi)

. RNAi merupakan potongan kecil

RNA yang dapat menginduksi penghancuran mRNA ter-

tentu sebelum dapat mengkode pembentukan protein di

dalam sitoplasma

(Gambar 3).

Sintesis protein merupakan ekspresi gen yang me-

liputi proses transkripsi dan translasi. Pada sel eu-

Gambar 2. Skema ANT untuk menghasilkan blastosis tanpa trofoblas.

Gambar 3. Mekanisme penghambatan ekpresi gen oleh RNAi.

Virus pembawa digunakan untuk memasukkan RNAi ke dalam sitoplasma

sel. RNAi dan mRNA akan saling menempel dan membentuk RNA-

In-

duced Silencing Complex (RISC). Mekanisme penghambatan ekspresi gen

tergantung pada kemiripan urutan basa dari RNAi dan mRNA. Penggu-

naan RNAi sangat efektif untuk menghambat ekspresi gen.

terutama karena pada ntESC

sel punca yang diperoleh dan

dikembangkan berasal dari tu-

buh pasien itu sendiri (

patient-

specific stem cells

). Peman-

faatan ntESC diharapkan

dapat mengatasi masalah

penolakan sistem imunitas

(

immune rejection

)

. Namun

aplikasi terapi berbasis sel

dengan menggunakan ntESC

masih harus diteliti lebih lan-

jut untuk mencegah potensi

timbulnya dampak negatif, se-

belum ditransplantasikan ke

tubuh pasien

Pemanfaatan teknologi

SCNT untuk menghasil-

kan ntESC sebagai alter-

natif terapi pada manusia

merupakan hal yang masih

diperdebatkan di berbagai

kalangan. Salah satunya

karena masalah etika peng-

gunaan oosit dan peru-

sakan embrio pada tahap

blastosis

. Permasala-

han etika lainnya adalah

adanya kekhawatiran di-

lakukannya proses kloning

dengan tujuan menciptakan suatu 'manusia baru' (

re-

productive cloning

). Hal ini menyebabkan William B. Hurl-

but mengemukakan gagasannya untuk memodifikasi sel

embrio agar tidak mampu berkembang menjadi embrio

normal yang mampu berimplantasi, yang disebut dengan

Altered Nuclear Transfer

(ANT)

sehingga diharapkan

dapat mengatasi permasalahan etika tersebut.

BQMJLBTJ!!BOU!!VOUVL!!NFOHIBTJMLBO!!ouFTD!

VOUVL!NFOHBUBTJ!NBTBMBI!FUJLB

Teknik ANT merupakan pengembangan teknik SCNT

untuk mengatasi permasalahan etika. Modifikasi teknik

SCNT meliputi pemanfaatan retrovirus untuk menyi-

sipkan RNAi pada sel donor inti sebelum ditransfer ke

sel oosit resipien. Keberadaan RNAi diharapkan dapat

menghambat ekspresi gen yang bertanggung jawab

terhadap proses pembentukan trofoblas, sehingga

diharapkan embrio berkembang menjadi cacat dan

tidak dapat berimplantasi.

Pada tahap blastosis, embrio akan membentuk trofek-

toderm dan ICM. Trofektoderm yang mengelilingi ICM

berperan dalam proses implantasi embrio pada jaringan

cdk 161/vol.35 no.2 Mar-Apr 2008

kariot umumnya ekspresi gen diawali dengan induksi

promoter terhadap proses transkripsi DNA menjadi

messenger

RNA (mRNA). DNA pada tahap ini dapat

dibedakan menjadi dua yaitu bagian

coding strand

(

sense strand atau nontemplate strand

) dan

template

strand

(

antisense strand

). Selanjutnya enzim RNA

polymerase akan membuat mRNA berdasarkan DNA

template strand

. Setelah mRNA terbentuk, akan ke-

luar dari inti sel dan menuju ke ribosom di sitoplasma.

Urutan basa nitrogen pada mRNA merupakan kodon

yang akan diterjemahkan oleh

transfer RNA

(tRNA)

menjadi asam amino yang sesuai. Proses ini disebut

dengan proses translasi

Penghambatan ekspresi gen Cdx2 pada teknik ANT di-

awali dengan penempelan RNAi pada mRNA memben-

tuk komplek RISC (

RNA-Induced Silencing Complex

)

RNAi dimasukkan ke dalam sitoplasma sel dengan ban-

tuan vektor lentivirus

. RNAi hanya dapat berikatan

dengan mRNA yang memiliki urutan basa yang meru-

pakan komplemennya. Dua mekanisme yang dapat ter-

jadi pada proses selanjutnya adalah: (1) apabila kom-

pleks RNAi dan mRNA (RISC) merupakan komplemen

(memiliki urutan basa yang cocok) dan dapat menem-

pel menjadi rantai RNA ganda maka enzim

slicer

dapat

memotong mRNA hingga terdegradasi, (2) apabila kom-

pleks RNAi dan mRNA bukan merupakan komplemen

(ada sedikit basa yang tidak bisa berpasangan) maka

mRNA tetap eksis tapi tRNA yang berada di ribosom

tidak mampu menerjemahkan urutan kodon menjadi

asam amino, sehingga proses translasi tidak dapat ter-

jadi

. Kedua mekanisme di atas menyebabkan proses

sintesis protein tidak berjalan sebagaimana mestinya

karena sehingga gen tidak terekspresikan

LFTJNQVMBO

ANT merupakan alternatif pengembangan teknik

SCNT untuk mengatasi permasalahan etika peng-

gunaan embrio sebagai sumber ESC. Pembentukan

trofoblas dapat dihambat dengan menggunakan RNAi

melalui inhibisi ekspresi gen Cdx2. Blastosis yang tidak

mengekspresikan gen Cdx2 tidak dapat implantasi, na-

mun sel-sel ICM masih dapat dikembangkan menjadi

sel punca yang bersifat pluripoten dan memiliki karak-

ter sama dengan ntESC.

EBGUBS!QVTUBLB

1. McLaren A. Cloning: pathway to a pluripotent future. Science 2000;

288: 1775-80.

2. Colman A. Somatic cell nuclear transfer in mammals: progress and

applications. Cloning 2000; 1: 185-200.

3. Wilmut I, Beaujean N, de Sousa PA, et al. Somatic cell nuclear transfer.

Nature 2002; 419: 583-6.

4. Tong WF, Ng YF, Ng SC. Somatic cell nuclear transfer (cloning): Implica-

tions for the medical practitioner. Singapore Med J. 2002; 43: 369-76.

5. Wakayama S, Ohta H, Kishigami S. Establishment of male and female

nuclear transfer embryonic stem cell line from different mouse and

tissues. Biol Reprod. 2005; 72: 932-6.

6. Hogan B, Costantini F, Lacy E. Manipulating the mouse embryo. A laborato-

ry manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Hal 113-4.

7. Moon SY, Park YB, Kim DS, Oh SK, Kim DW. Generation, culture, and

differentiation of human embryonic stem cells for therapeutic applica-

tions. Molecular Therapy 2006; 13: 5-14.

8. Freshney RI. Culture of animal cells. A manual of basic technique. 4th

ed. New York: Wiley-Liss, 2000; hal. 393.

9. Hochedlinger K, Jaenisch R. Nuclear reprogramming and pluripotency.

Nature 2006; 441: 1061-7.

10. Dinnyes A, Szmolenszky A. Animal cloning by nuclear transfer: state-of-the-

art and future perspectives. Acta Biochimica Polonica 2005; 52: 585-8.

11. Wobus AM, Boheler KR. Embryonic stem cells: prospects for develop-

mental biology and cell therapy. Physiol Rev. 2005; 85: 635-78.

12. Mombaerts P. Therapeutic cloning in the mouse. Proc Natl Acad Sci

USA. 2003; 100: 11924-5.

13. Wakayama T, Tabar V, Rodriguez I, Perry ACF, Studer L, Mombaerts

P. Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult

somatic cells by nuclear transfer. Science 2001; 292: 740-3.

14. Zhang P, Chebath J, Lonai P, Revel M. Enhancement of oligodendro-

cyte differentiation from murine embryonic stem cells by an activator

of gp 130 signaling. Stem Cells 2004; 22: 344-54.

15. Hipp J, Atala A. Tissue engineering, stem cells, cloning, and partheno-

genesis: new paradigms for therapy. Exp Clin Assist Reprod. 2004; I:3.

16. Lanza R, Moore MAS, Wakayama T, et al. Regeneration of the infract-

ed heart by nuclear transplantation.. Cir Res. 2004; 94: 820-7.

17. Kodifis T, de Bruin JL, Yamane T, et al. Insulin-like growth factor pro-

motes engraftment, differentiation, and functional improvement after

transfer of embryonic stem cells for myocardial restoration. Stem

Cells 2004; 22: 1239-45.

18. Paek HJ, Moise LJ, Morgan JR, Lysaght MJ. Origin of insulin secreted

from islet-like cell clusters derived from murine embryonic stem cells.

Cloning Stem Cells 2005; 7: 226-31.

19. Cibelli JB, Kiessling AA, Cunniff K, Richards C, Lanza RP, West MD. So-

matic cell nuclear transfer in humans: pronuclear and early embryonic

development. Regenerative Med. 2001; 2: 25-31.

20. Gardner RL. Stem cells and regenerative medicine: principles,

prospects and problems. C R Biologies 2006; doi:10.1016/

j.crvi.2007.01.005.

21. Whittaker PA. Therapeutic cloning: The ethical limits. J Taap. 2005;

270: S689-91.

22. Hurlbut WB. Altered nuclear transfer. N Engl J Med. 2005; 352: 1153-4.

23. Red-Horse K, Zhou Y, Genbacev O, et al. Trophoblast differentiation

during embryo implantation and formation of the maternal-fetal inter-

face. J Clin Invest. 2004; 114: 744-54.

24. Strumpf D, Mao CA, Yamanaka Y et al. Cdx2 is required for correct cell

fate specification and differentiation of trophectoderm in the mouse

blastocyst. Development 2005; 132: 2093-102.

25. Tolkunova E, Cavaleri F, Eckardt S, et al. The caudal-related protein

Cdx2 promotes trophoblast differentiation of mouse embryonic stem

cells. Stem Cells 2006; 24: 139-44.

26. Niwa H, Toyooka Y, Shimosato D, et al. Interaction between Oct3/4 and

Cdx2 determines trophectoderm differentiation. Cell 2005; 123: 917-29.

27. Meissner A, Jaenisch R. Generation of nuclear transfer-derived plurip-

otent ES cells from cloned Cdx2-deficient blastocysts. Nature 2006;

439: 212-5.

28. Findlay JK, Gear ML, Illingworth PJ, et al. Human embryo: a biological

definition. Human Reproduction 2007; 22: 905-11.

29. Robinson R. RNAi therapeutics: how likely, how soon?. P Bio. 2004; 2:

0018-20. DOI:10.1371/journal.pbio.0020028.

30. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular bi-

ology of the cell. 4th ed. New York: Garland Science, 2002; Hal 451-2.

31. Kalthoff K. Analysis of biological development. 2nd ed. New York: Mc-

Graw-Hill Co. Inc., 2001; Hal 395.

32. Campbell MK, Farrell SO. Biochemistry. 4th.ed. USA: Thomson Learn-

ing Inc., 2003; hal 281-2;320-1.

33. Gong W, Ren Y, Xu Q, et al. Integrated siRNA design based on survey-

ing of fetus features associated with high RNAi effectiveness. BMC

Bioinformatics 2006; doi:10.1186/1471-2105-7-516

34. Milhavet O, Gary DS, Mattson MP. RNA interference in biology and

medicine. Pharmacol Rev. 2003; 55: 629-48.

35. Yu J, Thomson JA. Embryonic Stem Cells. In Stem Cell Information [World

Wide Web site]. Bethesda, MD: National Institutes of Health, U.S. Depart-

ment of Health and Human Services, 2006 [cited Friday, January 26,

2007] Available at http://stemcells.nih.gov/info/scireport/2006report.