Cermin Dunia Kedokteran

Artikel

TINJAUAN KEPUSTAKAAN

Biologi Molekuler Hepatitis C

dan Aplikasi Diagnostiknya

Dr. Suwarso PhD

Laboratorium Patologi Klinik, Seksi Virologi-immunologi,

Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

PENDAHULUAN

Sejak tersedianya test diagnostik (1975) untuk hepatitis

virus A (HVA) dan hepatitis virus B (HVB), maka menjadi jelas

bahwa mayoritas kasus hepatitis post-transfusi (HPT) tidak di-

sebabkan oleh virus hepatitis A (VHA) ataupun B (VHB), juga

tidak disebabkan oleh virus-virus hepatotropik lain seperti virus

Cytomegalo (CMV) dan Epstein-Barr (EBV)

(1)

. Meskipun waktu

itu nama virus hepatitis C (VHC) telah diusulkan untuk meng-

gantikan nama HPT (HNANB = Hepatitis Non-A, Non-B)

(2,3,4)

namun karena metode serologi konvensional yang digunakan

(pada waktu itu merupakan satu-satunya metode yang diandal-

kan) tidak mampu mendeteksi adanya antigen atau antibodi virus

penyebab, maka nama VHC usulan Choo et al. yang dapat di-

terima setelah mereka pada tahun 1989 secara rekombinan pada

Bakteriofage gt 11 berhasil mengisolasi sebagian genom virus

penyebab HPT dan regio NS4 yang mengkode pengsintesaan

protein antigen 5.1.1 dan plasma penderita HNANB kronik

(5)

Kini seluruh genom dan protein antigen yang dikodenya

telah berhasil diisolasi dan disintesis secara rekombinan pada

vektor Bakteriofage atau Plasmid. Analisis serologik memper-

lihatkan bahwa antigen-antigen tersebut bereaksi dengan serum

penderita HNANB dan sejak itu pula diketahui bahwa VHC me-

rupakan penyebab pokok Karsinoma Hepatoseluler (KHS) di

negara-negara maju seperti Amerika, Eropa, Jepang dan meru-

pakan penyebab pokok untuk kasus-kasus Hepatitis Kriptogenik

di Itali

(5)

Teknik rekombinan ini diawali dengan pengisolasian mRNA

(sumber gen yang mengkode protein antigen VHC) yang ada

dalam pelet dan plasma Chimpanzee yang bertiter infeksius

tinggi ( 10

CID/ml). Oleh enzim Reverse Transcriptase,

dari setiap isolat mRNA niaterial infeksius akan dibentuk atau

dikopi satu single strand DNA homolog atau DNA komple-

menternya (ss-cDNA). Seterusnya olekenzim DNA-Polimerase

akan diproduksi banyak ss-cDNA yang secara spontan akan

membentuk double-heliksnya (ds-cDNA). Kode-kode genetik

pengsintesaan antigen VHC yang sekarang ada di ds-cDNA,

selanjutnya direkonstruksi atau direkombinasi dengan fragmen

DNA yang dapat bereplikasi dengan cepat yakni DNA dari

vektor plasmid atau bakteriofage (? 1). Akhirnya dengan

memasukkan vektor-vektor ini ke dalam jamur (Saccharomyces

cerevisiae) atau bakteri inangnya (E. coli) akan dihasilkan klon-

klon yang memproduksi protein antigen VHC dalam jumlah

yang berlebihan (Gambar 1).

Gambar 1. Isolasi mRNA Virus Hepatitis C dan Pemproduksian KIT EIA/

RIBA-Anti-VHC

secara

Rekombinan

Dipresentasikan pada simposium sehari tentang "Deteksi Awal & Penanggu-

langan Hepatitis B dan C dalam Peningkatan Sumber Daya Manusia". Solo

(PAPDI). 18 Juni 1994.

Cermin Dunia Kedokteran No. 110, 1996

Protein Antigen hasil rekayasa genetik (rekombinan) ini

akhirnya digunakan sebagai alat untuk mendeteksi antibodi

yang ada dalam sirkulasi darah penderita HVC, dapat secara

ELISA (Enzynze linked immunoassay) atau RIBA (Recombinant

immunoblotassay) (Gambar 1).

Mengingat bahwa VHC merupakan virus hepatitis yang

pertama yang dapat dideteksi dengan cara molekuler biologi,

maka dalam artikel ini akan diterangkan molekuler biologi VHC

dan aplikasi diagnosisnya.

STRUKTUR VIRION DAN SIFAT-SIFATNYA

VHC merupakan virus yang berenvelope, yang menginfeksi

sel hati dengan perubahan-perubahan tubuler sitoplasma. Dari

studi filtrasi diketahui bahwa virion atau virus utuh yang meng-

induksi perubahan tubuler sitoplasma memiliki diameter < 80

(6)

atau antara 3060 nm

(7)

, dan dengan elektron mikroskop

3662 nm

(8)

. Buoyant density virion yang diukur dengan gradien

densitas sukrosa adalah 1,141,18 g/cm3

(8)

, dan 1,301,36 g/cm3

dengan CsCl

(6)

. Dari dan hasil analisis sedimentasi disimpulkan

bahwa koefisien sedimentasi VHC <200S

(8)

VHC merupakan virus yang berenvelope karenanya infek-

tivitasnya dapat ditiadakan dengan pelarut-pelarut lemak seperti

kloroform dan beta-Propiolakton atau dengan pemanasan 60°C

selama 30 menit

(6)

STRUKTUR DAN FUNGSI GENOM VIRUS

Seperti terlihat pada gambar 2, VHC merupakan virus-virus

single strand RNA (ss-RNA). Genomnya bertipe positive-

strand RNA dengan panjang kurang lebih 9400 nukleotida (nt).

Genom terbagi dalam tiga bagian: dua bagian berupa regio

yang tidak ditranslasi (UTR = untranslation regio) yakni 5'-UTR

di ujung 5, 3-UTR di ujung 3, dan satu bagian merupakan regio

yang ditranslasi yang disebut open reading frame (ORF). Regio-

regio yang tidak ditranslasi terletak pada kec ujung genom

VHC, dengan demikian kedua UTR tersebut mengapit regio

yang ditranslasi (ORF).

ORF memiliki panjang 90309099 nt (membentang mulai

dan nt 342). Di dalam ORF inilah disimpan kode-kode genetik

untuk pengsintesaan 79 protein antigen virus, berturut-turut

adalah protein antigen struktural core dan struktural envelope-I,

masing-masing disimpan di ORF di regio C dan El; protein

antigen non-struktural-1 atau envelope-2 (NS1/E2), non-struk-

tural-2, -3, -4 (4a, 4b) dan -5 (5a, 5b), masing-masing disimpan

di regio NS1/E2, NS2, NS3, NS4 (NS4a, NS4b) dan NS5 (NS5a,

NS5b)

(9,10)

.Keseluruhan protein antigen yang dikode oleh ORF

ini tersusun dan 30103011 aa.

Gambar 2. Susunan Genom Virus Hepatitis C dan Produk Antigennya

5-UTR merupakan bagian, genom VHC tempat proses pem-

bacaan (translasi) kode-kode genetik dimulai. Dia memiliki

panjang 341 nt dan merupakan rantai yang sangat conserved,

artinya berbagai jenis genom VHC di berbagai negara (USA,

Australia, Italia, Jepang, Argentina, Afrika Selatan dan Taiwan)

memiliki rantai 5-UTR yang identik

(11)

. Lokasi 5-UTR tepat

upstream (di depan) ORF, dan memiliki peranan yang sangat

penting dalam proses replikasi atau pengsintesaan protein anti-

gen virus. Di dalam replikasi atau pengsintesaan protein virus, 5-

UTR berperan sebagai regulator (pengatur replikasi virus), hal

ini didukung dengan sifat-sifatnya sangat conserved, letaknya

yang direk upstream dan ORF, memiliki kodon-kodon initiator

AUG (kode-kode genetik untuk mengawali atau menginisiasi

replikasi atau pengsintesaan protein antigen virus) dan memiliki

kode-kode genetik untuk IRES (internal ribosome entry site)

yakni kode-kode genetik yang memungkinkan mRNA virus

berikatan dengan ribosom pembuat protein-protein (polipeptida)

antigen virus di sel hati.

Letak IRES pada 5' UTR ini membentang dari nt 101332,

sedang codon initiatornya (AUG) pada posisi nt 76 (AUG-76), 87

(AUG-87), 206 (AUG-206), 333 (AUG-333). Dari empat kodon

initiator yang dimiliki oleh VHC, ternyata kodon yang ke-IV,

yang digunakan oleh VHC untuk mengawali replikasi atau

pengintesaan proteinnya. Hal ini dimungkinkan, sebab rantai

5'- dan 3'-UTR yang mengapit ORF mengandung berturut-turut

struktur `Cap" dan `Poly-A", yang merupakan petunjuk bagi

ribosom untuk memilih kodon AUG yang dapat digunakan se-

bagai start-codon, agar diperoleh pengsintesaan protein antigen

virus yang efisien

(12)

Selanjutnya atas dasar kemiripan susunan regio struktural

(C, El) dan non-struktural (NS2-NSS), memperlihatkan bahwa

genom VHC mirip dengan genom virus dan famili Plavi- atau

Pesti-virus (Gambar 3). Hanya saja gp48 pada Pestivirus dan

Protein M (Matriks) pada Plavivirus menghilangkan pada VHC.

Dengan demikian masuk akal bahwa genom regmo struktural

VHC adalah lebih pendek daripada genom regio struktural Pesti-

dan Plavivirus. Sedang regio NS2-NS5 dari ketiga virus relatif

memiliki panjang yang identik.

Gambar 3. Struktur genom VHC dibanding dengan Plavi- dan Pestivirus.

gp = Glikoprotein, P = Protein, C = Core, M = Matriks, E =

Envelope,NS=Non-struktural, aa= Asam amino, nt =Nukletida,

5' & 3' = untranslasi regio (UTR) (Modifikasi dari Choo. et.al.

1990).

PROTEIN ANTIGEN VIRUS DAN ANTIBODINYA

Protein (polipeptid) antigen virus yang dikode oleh ORF

genom VHC kini secara rekombinan telah dapat dipurifikasi dan

Cermin Dunia Kedokteran No. 110, 1996

ditentukan masing-masing arti klinisnya. Protein antigen core

yang berhasil dipurifikasi adalah GOR, CP9, JCC, Po dan C22-

3. Aspek klinis antibodi yang ditujukan pada antigen-antigen ini

merupakan petanda (marker) infeksius. Kecuali antibodi ter-

hadap antigen GOR, antibodi-antibodi terhadap antigen-antigen

core lainnya hampir 90% dapat terdeteksi dalam sirkulasi darah

penderita HVC kronis, dan dengan metode Polymerase Chain

Reaction (PCR) umumnya dapat diketahui bahwa serum-serum

mereka memiliki RNA-VHC (Gambar 4). Peran antibodi ter-

hadap antigen-antigen core ini adalah membantu diagnosis VHC

pada kasus-kasus anti-C 100-3 (Ab terhadap antigen NS3-NS4)

negatip, yang pendeteksian RNA-VHC belum dikerjakan. Ke-

cuali antigen GOR, pengsintesaan antigen CP9, JCC, Po dan

C22-3 ada di bawah pengaruh kode-kode genetik yang ada di

dalam regio C dan ORF genom VHC. Antigen GOR merupakan

auto-antigen sintetik yang dikode oleh rantai genom sel hospes

dan tampaknya dia merupakan antigen nuklear sel hospes.

Protein Envelope-i merupakan protein yang terglikosilasi

(Glikoprotein =gp)dengan beratmolekul 33 Kilo Dalton (gp33),

dikode oleh regio El. Protein ini merupakan selubung terluar

VHC dan dinominasikan merupakan antigen yang dapat meng-

induksi antibodi yang dapat menetralkan virus. Dengan demi

kian merupakan novel antigen untuk mengembangkan vaksin.

Protein E2/NSI juga merupakan protein yang terglikosilasi

dengan berat molekul 72 Kilo Dalton (gp72), dikode oleh regio

E2/NS 1 dan genom VHC. Protein ini merupakan selubung kedua

seperti pestivirus, atau protein npn-struktural- 1 terluar seperti

Plavivirus. Adanya regio yang hypervariable pada regio E2/NS1,

ini menandakan bahwa protein atau antigen yang dikodenya

merupakan protein atau antigen yang dapat menginduksi anti-

bodi yang dapat menetralkan virus. Tapi nyatanya antibodi

terhadap antigen-E2 (Anti-E2) ini, lebih dan 50% terdeteksi pada

penderita-penderita HVC kronik, dan menghilang pada pende-

rita-penderita HVC yang berespon terhadap terapi interferon

(Yokosuka et al. 1993). Dengan demikian antibodi-E2 me-

rupakan marker replikasi VHC.

Protein NS2, NS3, NS4 dan NS5 merupakan protein non-

struktural dengan berat molekul berturut-turut 23kd (p23), 60kd

(p60), 52kd (p52) dan 1 l6kd (p116), dikode berturut-turut oleh

regio NS2, NS3, NS4 dan NS5 genom VHC. p23 dan p52 me-

miliki fungsi membran binding, p60 merupakan enzim protease/

helikase yang digunakan untuk sintesa protein virus, sedang

p116 merupakan enzim polimerase/reflikase yang berfungsi di

dalam reflikasi genom VHC (Gambar 2). Sebagai alat diagnos-

tik, produk antigen-antigen yang dikode oleh regio ini telah

tersedia secara komersial, dan dan Kit-diagnostik generasi lama

ke generasi yang lebih baru sensitivitas dan spesifisitasnya selalu

ditingkatkan dengan cara mengkombi nasikan antigen-antigen

ini. Pada EIA-Anti-HCV generasi-I, yakni EIA untuk mendeteksi

adanyaanti-HCV-Cl00-3 digunakan kombinasi protein antigen

yang berhasil diisolasi oleh Choo et al. yakni Ag 5.1.1 (Ag yang

dikode oleh regio NS4) dengan protein antigen yang dikode oleh

sebagian regio NS3; Pada EIA generasi-II yakni EIA untuk

mendeteksi antibodi-HCV-C200, protein antigen yang dikom-

binasikan pada Ag 5.1.1 tidak hanya protein Ag yang dikode oleh

sebagian regio NS3, tapi sudah dengan protein Ag yang dikode

oleh seluruh regio NS3 dan akhirnya pada EIA generasi terbaru/

generasi-III (mendeteksi adanya anti-HCV-C825) protein Ag

yang dikode oleh regio NS5 ditambahkan (Gambar 4).

Gambar 4. Susunan Genom Virus Hepatitis C dan Produk Antigen Ko-

mersialnya

Antibodi-antibodi terhadap protein-protein antigen ini

merupakan marker infeksius, sebab banyak terdapat pada pende-

rita-penderita HVC kronik (Gambar 5).

Gambar 5. Positive rate epitope HCV dengan test konfirmasi Polymerase

Chain Reaction (PCR). Modifikasi dari Yatsuhashi et .al.(1993).

TIPE, SUB-TIPE DAN DISTRIBUSI VIRUS

Sejak genom VHC berhasil dianalisis

(5)

. Kini minimal di

dunia secara genotipeada 7 tipe pokok VHC, yakni VHC I-VII

(Tabel 1). Masing-masing tipe berdasarkan pada persamaan

(homolog) nukleotida yang menyusun regio genomnya (ho-

molog nt <72% signifikan berbeda) kemudian dapat dibagi lagi

ke dalam 23 subtipe (ac). Prevalensi sub-tipe tampak ber-

Cermin Dunia Kedokteran No. 110, 1996

Aspek klinis lain dengan adanya subtipe adalah timbulnya

infeksi multipel, yakni satu individu mengalami infeksi berulang

oleh VHC. Jadi adanya infeksi multipel pada seseorang perlu

mendapat perhatian yang serius, sebab mayoritas (>50%) indi-

vidu yang terinfeksi oleh VHC dengan beda tipe, penyakitnya

akan berjalan kronis dan umumnya di dalam tubuh penderita ini

akan terdeteksi lebih dari satu tipe VHC.

variasi antara daerah geografik yang berbeda. VHC-I (subtipe

1a) yang berhasil diisolasi dan chimpanzee yang diinfeksi oleh

faktor VIII konsentrat yang menyebabkan HNANB pada resi-

piennya (penderita hemofilia) banyak terdapat di USA, Australia

dan negara-negara Eropa Barat. VHC-I (Ia) ini umumnya me-

rupakan VHC yang ditemukan pada penderita-penderita hemo-

dialisis. VHC- 1a tidak diketemukan pada 52 penderita hepatitis

kronik dan sirosis hati, tapi sebaliknya umum pada penderita-

penderita yang dihemodialisis

(9)

. Di Yogyakarta kami menemu-

kan bahwa VHC-subtipe-1a merupakan VHC yang mayoritas ter-

dapat pada pasien-pasien hemodiaIisis

(10)

. VHC-II (1b) banyak

terdapat di Jepang, Korea, Taiwan, China, dan di Indonesia

merupakan subtipe yang paling umum ditemukan (48%) pada

penderita-penderita penyakit hati kronis dan umumnya meru-

pakan subtipe yang berespon jelek terhadap terapi interferon.

Sub-tipe Ic (HC-G9, Td-6?), sejauh ini merupakan subtipe yang

spesifik ada di Indonesia; Subtipe ini lebih banyak ditemukan

pada penderita-penderita sirosis hati dan pada hepatitis kronis

(34% vs 20%). VHC-III (2a) dan IV (2b) merupakan VHC yang

berespon baik terhadap Interferon. Tipe 2a banyak terdapat di

Jepang dan di Indonesia tercatat >20% sebaliknya tipe 2b ter-

dapat di Jepang dan tidak ditemukan di Indonesia. VHC-V (3a)

di Thailand, Inggris, Brazil dan sejauh ini tidak ada di Indonesia,

VHC-VI (3b) di Thailand dan Jepang, VHC-VII (4a) di Afrika

Selatan

(9)

Mengingat bahwa awal timbulnya kasus dan terdeteksinya

VHC adalah dan pemakaian darah dan produk-produknya se-

perti faktor-faktor pembekuan yang biasa digunakan pada kasus-

kasus hemophilia, immunoglobulin yang diberikan untuk kasus-

kasus immunisasi pasif, dan bahkan vaksin-vaksin yang berasal

dari donor plasma, pemakaian bahan-bahan ini perlu lebih se-

lektif.

KEPUSTAKAAN

1. Feinstone SM, Kapikian AZ, Purcell RH, AlterHJ, Holand PV. Transfusion

associated hepatitis not due to viral hepatitis type A or B. N. Engl. J. Med.

1975; 292: 76770.

2. Prince AM, Brotman B, Grady GF et al. Long incubation posttransfusion

without serological evidence of exposure to hepatitis B virus. Lancet 1974;

2: 241246.

3. Shirachi R, Tateda A, Shiraishi H, Kikuchi K, Ishida N. "Hepatitis C"

antigen in NANB-postransfusion hepatitis. Lancet 1978; 2: 853856.

4. Villarejos VM, Provos PJ, Ittensohn OL, McLean AA, Hilleman MR.

Seroepidemiologic investigations of human hepatitis caused by A, B and a

posible third virus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1976; 152: 524528.

Tabel 1. Tipe dan Subtipe VHC

Tipe Subtipe Genotipe

Isolat

Keterangan

III

VII

USA

Eropa

Australia

Indonesia

Jepang

Korea

Taiwan

China

Indonesia

Jepang

Indonesia

Jepang

Thailand

Inggris

Brazil

Thailand

Jepang

Afrika Selatan

Hemodialisis

Hepatitis kronis

Kebal interferon

Sirosis hati

Peka interferon

5. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M.

Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne NANB-viral

hepatitis genome. Science. 1989; 244: 35962.

6. BradleyDW, McCaustland KA, Cook EH, SchableCA, EbertiW, Maynard

JE. Posttransfusion NANBH in Chimpanzees: Physicochemical evidence

that the tubule-forming agent is small, enveloped virus. Gastroenterol.

1985; 88: 77379.

7. He LF, Ailing D, Popkin T, Shapiro M, Alter HJ, Purcel RH. Determining

the size of non-A, non-B hepatitis virus by filtration. J. Infect. Dis. 1978;

156: 63640.

8. Hollinger FB. Non-A, non-B hepatitis viruses. In: Field BN, Knipe DM.

Eds. Virology, second ed. Vol. 2. New York: Raven Press 1990; 2:

22392273.

9. Hotta H., Handajani R, Lusida MI, Widawati, Doi H, Miyajima H, Homma

M. Subtype analysis of hepatitis C virus in Indonesia on the basis of NS5b

region sequences. 2nd Nat Congr Indonesian Society for Clinical Patho-

logy (PDS PATKLIN), Surabayn Januari, 293 12, 1994.

10. Hotta H, Doi H, Hayashi T, Mariyam, Lusida INI, Widawati, Homma M.

Sequence analysis of hepatitis C virus obtained from Indonesia patients

and identification of novel sequence variants. Viral Hepatitis and Liver

Disease. 1994 (in press).

11. Hari JH, Shyamala V, Richman KH et al. Characterization of the terminal

regions of hepatitis C virus RNA: identification of conserved sequences in

the 5' untranslated region and poly (A) tails at the 3' end. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 1991; 88: 171115.

Telah diketahui bahwa virus-virus RNA mudah sekali untuk

mutasi secara spontan

(13)

. Karenanya masuk akal jika perbedaan

tipe dan virulensi ini muncul pada VHC. Adanya perbedaan tipe

ini karena di antara VHC yang berhasil diisolasi memiliki per-

bedaan panjang atau adanya substitusi pada jumlah nukleotida

yang menyusun rantai genomnya (tapi dan kebanyakan isolat

yang ada, hanya regio Core dan NS3 yang konservasi). Selan-

jutnya perbedaan subtipe ini memegang peran pula dalam berat

ringannya hepatitis dan respon terhadap terapi interferon.

12. Kohara KT, lizuka N, Kohara M, Nomoto A. Internal ribosome entry site

within hepatitis C virus RNA. J. Virol. 1992; 66: 14761483.

13. Domingo E, Martinez-Salas E et al. The Quasispecies (extremely hetero-

gene) nature of viral RNA genome populations: Biological relevance-a

review. Gene 1985; 40: 18.

14. Yatsuhashi H, Inokuchi K, lnoue 0 et al. The clinical significance of

reactivity to individual epitopes of the hepatitis C viral genome. Gastro-

enterol. Jpn. 1993; 28. (Suppl. 5): 61l.

Cermin Dunia Kedokteran No. 110, 1996